背景及概述[1]
大腸桿菌經(jīng)Ca離子處理后可攝取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱作感受態(tài)細(xì)胞(Competent Cells)。OrigamiB(DE3)菌株包含突變的硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase）(trxB) 和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase)(gor)基因，表達(dá)主要還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。 該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，具有卡那霉素和四環(huán)素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的表達(dá)。OrigamiB (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)108 cfu/μg DNA。
操作方法[1]
1. Origami B (DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。
2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。
4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。
基因型[1]
F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB (KanR,TetR)
注意事項(xiàng)[1]
1. 感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。
4. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。
5. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。
主要參考資料
[1] OrigamiB(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)