背景[1-3]
DELAFIELD蘇木素染色液是一種用于生物學和醫(yī)學實驗的染色劑，特別適用于非木質化組織的染色。這種染色液主要由蘇木精和其他成分組成，可以與番紅對染，對多種植物病害組織染色能夠取得良好的效果。
在染色過程中，蘇木精作為一種堿性天然染料，可以使細胞核著色。這是因為細胞核內染色質的主要成分是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精堿性染料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。
Delafield蘇木素染色液的使用方法通常包括將組織切片浸泡在染色液中一定時間，然后進行清洗和分化處理。在HE染色中，常用1%鹽酸乙醇作為分化液，因為酸能破壞蘇木素的醌型結構，使組織與色素分離而退色。此外，染色液還需要在特定的保存條件下保存，如室溫、避光等。
DELAFIELD蘇木素染色液
Delafield蘇木素是通過對蘇木素進行自然氧化處理而制成的，這一過程涉及將蘇木素暴露于光和空氣中，讓其自然氧化成蘇木紅。這個過程比較緩慢，通常需要3到6個月的時間。經過這樣處理的蘇木素染色能力可以維持很長時間。在使用Delafield蘇木素染色液之前，建議先進行過濾，以確保染色效果。
在實驗室中，Delafield蘇木素染色液主要用于染色細胞核，其染色結果呈現出紫色或藍紫色，便于在顯微鏡下觀察和分析細胞結構。由于其優(yōu)異的染色能力和較長的可用期限，Delafield蘇木素染色液成為了科研和病理診斷中非常受歡迎的一種染色劑。
應用[4][5]
DELAFIELD蘇木素染色液可以用于Eya2在前列腺癌中過表達，通過AKT/Bcl-2通路調控前列腺癌細胞線粒體功能及多西紫杉醇敏感性
探究Eya2在前列腺癌中的表達模式,臨床意義,表達差異對前列腺癌細胞生物學功能的影響以及潛在的分子生物學機制,以判斷Eya2是否可能作為前列腺癌早期診斷的生物標記物。
研究方法:1組織樣本98例人類前列腺癌組織和16例前列腺正常組織來自于2013至2016年在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院就診的患者。2免疫組織化學前列腺癌組織樣本切除后浸入甲醛溶液固定,石蠟包埋處理并保存。制作石蠟切片,脫蠟后經抗原修復、BSA封閉后,滴加一抗(Eya2)孵育過夜。滴加生物素標記的二抗繼續(xù)孵育。抗體孵育結束后DAB顯色試劑盒顯色,DELAFIELD蘇木素染色液復染細胞核,脫水透化后進行封片。統(tǒng)計染色強度和陽性百分比,估算Eya2在前列腺組織中的表達情況。3細胞培養(yǎng)本實驗所用細胞系為:人類前列腺上皮細胞RWPE-1(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),人類前列腺癌細胞DU145(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),LNCaP(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),PC-3(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫),人類293細胞(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)。培養(yǎng)條件為:含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基,37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)。4 Western Blot收集蛋白進行丙烯酰胺凝膠電泳,所用一抗為:Eya2、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase3、PRAP、AKT、p-AKT、Bcl-2、MMP7和actin。樣本經過辣根過氧化物酶耦合二抗孵育2小時,ECL發(fā)光。5實時定量RT-PCR使用TRIZOL提取總RNA,使用iScriptTM Reverse Transcription Supermix試劑盒進行反轉錄。RT-PCR使用SYBR Green MasterMix試劑采集熒光信號。所用儀器為ABI 7500。actin為內參基因,基因擴增倍數參照2-ΔΔct法。
6 Eya2質粒轉染和shEya2穩(wěn)轉Eya2 shRNA、pMD2.G和pspax2均購于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000進行慢病毒轉染,puromycin進行細胞篩選。Eya2質粒購于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000進行Eya2質粒轉染實驗。7 CCK8和集落形成實驗CCK8:重懸處理后細胞,以3000個細胞/孔的密度接種于96孔板,分別在24h、48h、72h、96h使用CCK8檢測細胞增殖情況,繪制折線圖觀測Eya2表達差異對細胞增殖的影響。集落形成實驗:重懸處理后細胞,均勻接種于6cm皿中,連續(xù)培養(yǎng)2周。固定后吉薩姆染色液染色,晾干后采集圖像。對集落進行計數,分析Eya2表達差異對集落形成的影響。8 Transwell凝膠侵襲實驗將處理后細胞重懸加至包被有Matrigel的Transwell上室中。Transwell上室血清濃度為3%,下室血清濃度為13%,37℃飽和濕度培養(yǎng)18h。取出上室,擦去上層Matrigel,固定打孔并使用DELAFIELD蘇木素染色液染色。風干后裁下基底膜,中性樹膠封片。對細胞進行計數,分析Eya2表達差異對細胞侵襲能力的影響。
參考文獻
[1]Targeting prosurvival BCL2 signaling through Akt blockade sensitizes castration-resistant prostate cancer cells to enzalutamide.[J].Pilling Amanda B;;Hwang Clara.The Prostate,2019
[2]A colorimetric paper sensor for citrate as biomarker for early stage detection of prostate cancer based on peroxidase-like activity of cysteine-capped gold nanoclusters[J].Shima Abarghoei;;Neda Fakhri;;Yasaman Sadat Borghei;;Morteza Hosseini;;Mohammad Reza Ganjali.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2019
[3]Cistanche tubulosa phenylethanoid glycosides induce apoptosis in Eca?109cells via the mitochondria?dependent pathway[J].Changshuang Fu;;Jinyu Li;;Adila Aipire;;Lijie Xia;;Yi Yang;;Qiuyan Chen;;Jie Lv;;Xinhui Wang;;Jinyao Li.Oncology Letters,2019(1)
[4]Rafoxanide,an organohalogen drug,triggers apoptosis and cell cycle arrest in multiple myeloma by enhancing DNA damage responses and suppressing the p38 MAPK pathway[J].Wenqin Xiao;;Zhijian Xu;;Shuaikang Chang;;Bo Li;;Dandan Yu;;Huiqun Wu;;Yongsheng Xie;;Yingcong Wang;;Bingqian Xie;;Xi Sun;;Yuanyuan Kong;;Xiucai Lan;;Wenxuan Bu;;Gege Chen;;Lu Gao;;Xiaosong Wu;;Jumei Shi;;Weiliang Zhu.Cancer Letters,2018
[5]劉重遠.Eya2在前列腺癌中過表達，通過AKT/Bcl-2通路調控前列腺癌細胞線粒體功能及多西紫杉醇敏感性[D].中國醫(yī)科大學,2021.