背景^[1-3]

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒是一種用于檢測(cè)大鼠樣本中骨粘連蛋白（ON）水平的實(shí)驗(yàn)工具。

以下是關(guān)于該試劑盒的一些基本信息：

實(shí)驗(yàn)原理：該試劑盒采用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠骨粘連蛋白（ON）水平。通過純化的大鼠骨粘連蛋白（ON）抗體包被微孔板制成固相抗體，加入待測(cè)樣本中的骨粘連蛋白（ON），再與HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的骨粘連蛋白（ON）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過洗滌后，加入底物TMB進(jìn)行顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的骨粘連蛋白（ON）濃度呈正相關(guān)。最后，使用酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定吸光度（OD值），并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠骨粘連蛋白（ON）的濃度。

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒操作步驟：

實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒結(jié)果影響因素：影響ELISA結(jié)果測(cè)定的因素主要包括標(biāo)本因素、試劑因素和操作因素。例如，標(biāo)本的采集、保存和處理方式可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；試劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；操作過程中的溫度、時(shí)間、洗滌次數(shù)等因素也可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒注意事項(xiàng)：在使用大鼠骨粘連蛋白（ON）ELISA試劑盒時(shí)，需要注意以下幾點(diǎn)：首先，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境干凈、整潔，避免污染；其次，按照說明書的要求進(jìn)行加樣和操作；第三，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)過程中的溫度和時(shí)間；第四，及時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析；最后，注意實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀和判斷。

應(yīng)用^[4][5]

大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒可以用于β-磷酸三鈣對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響及骨粘連蛋白的純化

從生物學(xué)和分子生物學(xué)的角度來探討鈣磷降解材料參與構(gòu)建有生命組織的機(jī)制，開展鈣磷降解材料生物礦化的生物學(xué)。在本實(shí)驗(yàn)中，分別用組織塊法和酶消化方法從Wister新生乳鼠的顱骨中分離了成骨細(xì)胞，并對(duì)所獲得的細(xì)胞用差速貼壁方法進(jìn)行純化，并進(jìn)行堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)染色，染色后的結(jié)果證明兩種方法所獲得的成骨細(xì)胞具有良好的生物學(xué)特性。

將成骨細(xì)胞和鈣磷降解材料混合培養(yǎng)后，顯微鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞對(duì)β-TCP顆粒有明顯的吞噬作用。同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)分析表明，β-TCP有利于成骨細(xì)胞的生長和增殖。將成骨細(xì)胞和β-TCP顆?；旌吓囵B(yǎng)一段時(shí)間以后，提取成骨細(xì)胞的總RNA，運(yùn)用RT-PCR、PCR手段來檢測(cè)鈣磷材料對(duì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。合成并設(shè)計(jì)成骨細(xì)胞相關(guān)基因的引物，RT-PCR、PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，β-TCP顆?？梢燥@著促進(jìn)成骨細(xì)胞中與成骨作用相關(guān)的基因，如堿性磷酸酶(ALP)mRNA、骨粘連蛋白(ONN)mRNA的表達(dá)。由于β-TCP能促進(jìn)成骨細(xì)胞骨粘連蛋白mRNA表達(dá)。

因此，為了探討骨相關(guān)蛋白在礦化過程中的作用，將大鼠骨粘連蛋白基因重組到原核表達(dá)載體pET28a中，構(gòu)建了可以表達(dá)ONN的pHX201／ONN表達(dá)載體。同時(shí)將本中心已經(jīng)構(gòu)建的大鼠骨粘蛋白表達(dá)載體pGEX-KG2／ON，以及新構(gòu)建的pHX201／ONN表達(dá)載體分別插入到大腸桿菌E．coli BL21(DE3)pLyS和R1L菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，大鼠骨粘連蛋白(ON)Elisa試劑盒結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGEX-KG2／ON表達(dá)載體比pHX201表達(dá)載體更有利于骨粘蛋白的表達(dá)。并進(jìn)一步對(duì)pGEX-KG2／ON表達(dá)載體的表達(dá)和純化條件進(jìn)行優(yōu)化，將含有pGEX-KG2／ON表達(dá)載體的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，并將增菌后的菌液通過離心、細(xì)菌破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾管分離、GST親和層析柱層析逐步純化，獲得了純度較高GST融合蛋白。

參考文獻(xiàn)

[1]The effect of 3-hydroxybutyrate on the in vitro differentiation of murine osteoblast MC3T3-E1 and in vivo bone formation in ovariectomized rats[J].Yan Zhao;;Bing Zou;;Zhenyu Shi;;Qiong Wu;;Guo-Qiang Chen.Biomaterials,2007(20)

[2]Cloning and expression of osteonectin gene from rats[J].Zhou Lingde;;Yuan Lin;;Yan Yuhua;;Li Shipu.Journal of Wuhan University of Technology-Mater.Sci.Ed.,2006

[3]Characterization of Sparus aurata osteonectin cDNA and in silico analysis of protein conserved features:Evidence for more than one osteonectin in Salmonidae[J].Vincent Laizé;;António R.Pombinho;;M.Leonor Cancela.Biochimie,2005(5)

[4]Effect of Macrophage on Degradation ofβ-TCP Ceramics[J].Li Shi Pu;;Dai Hong Lian;;Yan Yu Hua;;Cao Xian Ying;;Zheng Qi Xin.Key Engineering Materials,2005(288)

[5]汪靜.β-磷酸三鈣對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響及骨粘連蛋白的純化[D].武漢理工大學(xué),2007.