背景及概述[1]
內(nèi)皮細(xì)胞系指血管、淋巴管的內(nèi)膜上皮將內(nèi)腔面覆蓋的細(xì)胞。多數(shù)是單層扁平上皮屬中胎葉性的上皮。血液循環(huán)和組織中大單核的游走的吞噬細(xì)胞有人認(rèn)為是來(lái)自增生的血管內(nèi)皮。小鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分離自淋巴管組織；淋巴管由毛細(xì)淋巴管匯合而成。其形態(tài)結(jié)構(gòu)與靜脈相似，但管徑較細(xì)，管壁較薄，瓣膜較多且發(fā)達(dá)，外形呈串珠狀。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是構(gòu)成血一腦屏障的主要成分，而且在腦的物質(zhì)代謝、纖溶與止血、炎癥與免疫等方面發(fā)揮特殊的作用。由于體外培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞保持了較多的體內(nèi)固有的特點(diǎn)，因此，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型已被廣泛用于心腦血管疾病的病理生理、藥物篩選及藥理學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。自從首次分離培養(yǎng)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞以來(lái)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)技術(shù)被用于相關(guān)研究領(lǐng)域。為了使體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)研究以同一種系動(dòng)物作為研究對(duì)象，有研究借鑒已報(bào)道的大鼠和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，主要對(duì)兩種方法進(jìn)行了比較和改進(jìn)，成功地進(jìn)行了小鼠腦微血管段分離和內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，獲得了純度較高的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
體外培養(yǎng)[2]
方法1：小鼠頸椎脫臼處死后，浸泡于75%乙醇3~5min，斷頭置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，無(wú)菌打開(kāi)顱腔，取出全腦置于盛有冷PBS的培養(yǎng)皿中，去除小腦、間腦(包括海馬)之后，將大腦置于無(wú)菌的濾紙上輕輕滾動(dòng)，以除去軟腦膜及腦膜的大血管，之后將分離好的腦組織置于新的冷PBS中，再用細(xì)解剖鑷將殘余的軟腦膜、軟腦膜上的大血管、大腦白質(zhì)等去除干凈，保留大腦皮質(zhì)，用PBS洗3遍，加人1mlDMEM培養(yǎng)液，用虹膜剪將其剪成1mm3大小，加人0.1%H型膠原酶(含30U/mlDNasel，0.5ml大腦)混勻后置于37aC水浴1.5:-2h，室溫中離心，1000r/min，8min，棄上清液；加入巧%葡聚糖懸浮混勻后4℃離心，4000r/min，20min，小心吸去中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀物(含腦微血管段)；加人2ml0.1%膠原酶/分散酶(含20U/mlDNasel)懸浮混勻后370℃水浴1.5-2h，室溫中離心，1000r/min，8min，棄上清液(此處省去原方法中50%Pere0ll密度梯度離心)；沉淀用DMEM洗2次，室溫中離心，1000r/min，5min，棄上清液，加人DMEM完全培養(yǎng)液懸浮后接種于涂布有1mg/mlVI型膠原和纖連蛋白的6孔或者24孔的一次性塑料培養(yǎng)皿，置于37℃、5%C()：培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，12-24h換液1次，隨后每天觀察，隔天換液。
方法2：分離小鼠大腦皮質(zhì)的過(guò)程同方法1，將剪碎的腦組織放人無(wú)菌的玻璃勻漿器中上下抽動(dòng)3次，通過(guò)0.25mm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，收集過(guò)濾液，加人15%葡聚糖懸浮混勻后4℃離心(4000r/min，15min)，棄上清液，取沉淀物加人15ml0.1%膠原酶/分散酶(含有2%FBS，30U/mlDNasel)置370C水浴6h(中間伴有輕微的搖動(dòng))，室溫中離心(1000r/min，5min)，棄上清液(此處省去原方法中45%Pere0ll)，沉淀物用2mlDMEM洗l次(1000r/min，5min)，棄上清液，加人DMEM完全培養(yǎng)液，以后步驟同方法1。
結(jié)果：采用兩種方法分離的腦微血管段于接種當(dāng)時(shí)，均可見(jiàn)由圓形的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的呈單支狀和分支狀的腦微血管段，并可見(jiàn)散在的單細(xì)胞及組織碎片(圖IA、IE)；培養(yǎng)12h時(shí)可見(jiàn)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞從貼壁的微血管段周?chē)莱?圖IB、I)F；培養(yǎng)至第3一5日，可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞呈短梭形，區(qū)域性單層生長(zhǎng)(圖IC、ID、IG、IH)；培養(yǎng)至第7日時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)呈“漩渦狀”，可見(jiàn)各處細(xì)胞匯合生長(zhǎng)(圖2)；培養(yǎng)至第5~7日的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞用免疫熒光法鑒定姍因子相關(guān)抗原，于熒光顯微鏡下觀察，90%以上呈陽(yáng)性。
相關(guān)研究[3]
有試驗(yàn)研究輔酶Q10抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增殖的作用及其可能機(jī)制。方法：用血清藥理學(xué)方法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)體外培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)中不同濃度C0Q10對(duì)細(xì)胞凋亡和增殖的變化。用免疫細(xì)胞化學(xué)ABC法觀察Fas蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：與對(duì)照組比(加不含藥血清)，在bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)中加入50μL、25μL、125μL含C0Q10的血清組細(xì)胞凋亡明顯抑制(P005)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果證明，此時(shí)Fas蛋白表達(dá)明顯減弱，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P005)。但C0Q10對(duì)細(xì)胞增殖影響不顯著。
此外，還有實(shí)驗(yàn)研究無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其可能機(jī)制。方法培養(yǎng)用小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分比；用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)；用WesternBlot檢測(cè)caspase3蛋白表達(dá)。結(jié)果bEnd.3細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清饑餓體外培養(yǎng)12，24，36h后細(xì)胞凋亡率明顯增加，分別為(13.79±0.99)%，(17.80±1.39)%，(20.51±0.55)%，與各自正常血清培養(yǎng)的對(duì)照組凋亡率相比，P0.01。Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)明顯減弱，caspase3明顯增強(qiáng)。
主要參考資料
[1]現(xiàn)代藥學(xué)名詞手冊(cè)
[2]小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純化
[3]輔酶Q-(10)對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和增殖的影響
[4]無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制