背景^[1-6]

細(xì)胞系定制服務(wù)是將外源質(zhì)粒DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長(zhǎng)期表達(dá)目的蛋白，稱穩(wěn)定細(xì)胞系。高質(zhì)量的穩(wěn)定細(xì)胞系在生物學(xué)研究中扮演著非常重要的角色，包括基因功能研究、重組抗體、藥物開發(fā)等。細(xì)胞系定制服務(wù)構(gòu)建的細(xì)胞系可直接應(yīng)用于各種下游的生物學(xué)研究，包括基因調(diào)控、蛋白質(zhì)工程、重組抗體制備、藥物研發(fā)等。細(xì)胞系定制服務(wù)包括基因過表達(dá)（Reporter細(xì)胞系、GPCR細(xì)胞系、離子通道細(xì)胞系等）、Knockdown、Knockout細(xì)胞系等。

1. 過表達(dá)細(xì)胞系服務(wù)

目的基因過表達(dá)是研究基因功能常用的手段之一。基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究，包括基因調(diào)控、蛋白質(zhì)工程、重組抗體制備、藥物研發(fā)等。將目的基因通過轉(zhuǎn)染或病毒包裝的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)目的基因過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系有GPCR、Reporter和離子通道穩(wěn)定細(xì)胞系等，此外還可以根據(jù)客戶的需要進(jìn)行量身定做，在各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)各種基因?；谕晟频幕蜻^表達(dá)技術(shù)，過表達(dá)細(xì)胞系服務(wù)可將目的基因定點(diǎn)整合到基因組的高表達(dá)活性位點(diǎn)中，這些位點(diǎn)不僅安全而且基因表達(dá)量高，可以實(shí)現(xiàn)目的基因過表達(dá)，并能長(zhǎng)期穩(wěn)定遺傳。

2. Knockdown(基因敲低)細(xì)胞系服務(wù)

RNA干擾是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的主要起干擾作用的主要有兩類小分子RNA：一類是microRNA；另一類是siRNA。siRNA制備的方法一般有:化學(xué)合成siRNA，哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體shRNA克隆和慢病毒載體shRNA克隆。shRNA需通過載體導(dǎo)入細(xì)胞后，然后利用細(xì)胞內(nèi)的酶切機(jī)制得到siRNA而最終發(fā)揮RNA干擾作用。

在細(xì)胞水平上，利用RNA干擾技術(shù)來抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，從而獲得knockdown的基因敲低細(xì)胞系，已廣泛應(yīng)用于研究基因功能，設(shè)計(jì)疾病模型和藥物研發(fā)中。安必奇憑借先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，完善的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)可以針對(duì)各種目標(biāo)基因設(shè)計(jì)高效的shRNA，并利用shRNA的慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建種類齊全的各種基因knockdown穩(wěn)定細(xì)胞系。

3. Knockout(基因敲除)細(xì)胞系服務(wù)

Knockout基因敲除細(xì)胞或動(dòng)物模型一直以來是開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶點(diǎn)的重要工具。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的一種適應(yīng)性免疫機(jī)制，用來抵抗各種外來核酸的入侵。CRISPR/Cas9技術(shù)與ZFN、TALEN相比，更為高效、便捷，成為基因編輯的一個(gè)重要工具，在基因工程領(lǐng)域開創(chuàng)了新紀(jì)元。改造優(yōu)化后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由兩部分組成：sgRNA和Cas9蛋白。sgRNA特異性識(shí)別靶位點(diǎn)后，Cas9蛋白在靶位點(diǎn)附近進(jìn)行切割，從而形成DSB。

技術(shù)流程：

1.載體構(gòu)建-目的基因過表達(dá)載體的構(gòu)建。

2.病毒包裝-表達(dá)載體、輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集病毒上清，純化和濃縮病毒顆粒。若選擇轉(zhuǎn)染，則跳過此步。

3.轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)-電轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體等）進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。

4.篩選-根據(jù)表達(dá)載體的篩選基因選擇藥物進(jìn)行篩選，如嘌呤霉素、G418等。

5.擴(kuò)大培養(yǎng)-將篩選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

6.鑒定-PCR、Q-PCR、western等從DNA、mRNA、蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。

應(yīng)用^[7][8]

細(xì)胞系定制服務(wù)可用于設(shè)計(jì)疾病模型，用于研究疾病的診斷治療方法。

在骨肉瘤干細(xì)胞及其多藥耐藥性的體內(nèi)外相關(guān)研究：骨肉瘤是人類最常見的惡性骨腫瘤,好發(fā)于青少年,惡性程度高,易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移,有較高的致死和致殘率。研究骨肉瘤多藥耐藥的機(jī)制首先要在體內(nèi)外建立骨肉瘤多藥耐藥的模型。耐藥模型的建立的方法一般有兩種：成熟細(xì)胞系誘導(dǎo)或者耐藥骨肉瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)。其中前者更具有穩(wěn)定性、代表性和說服力U2OS是研究常用的人骨肉瘤細(xì)胞系,但由于其體內(nèi)致瘤率低而不利于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行,因此我們還選取了具有較高致瘤性的MNNG/HOS人骨肉瘤細(xì)胞系,通過化療藥物誘導(dǎo)建立此三種細(xì)胞系的骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞模型。骨肉瘤干細(xì)胞是骨肉瘤中一小群具有自我更新和分化功能的細(xì)胞。通常這部分細(xì)胞處于靜止期,當(dāng)受到刺激或者周圍微環(huán)境改變時(shí),它就會(huì)不斷增殖分化成異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞。骨肉瘤干細(xì)胞具有無限增殖、多藥耐藥和高致瘤性等特點(diǎn),常規(guī)治療方法很難將其殺滅,所以它們被看做是骨肉瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的罪魁禍?zhǔn)住?/p>

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