背景[1-3]
NRK-52E(大鼠腎細胞)是從大鼠腎近曲小管分離出來的具有上皮形態(tài)的細胞系，為自發(fā)永生化細胞。NRK-52E是常用的腎臟細胞模型，有助于揭示腎臟疾?。ㄈ缒I纖維化、鈉代謝紊亂、糖尿病等）的發(fā)展機制，以及評估藥物的腎臟毒性，對開發(fā)新的治療策略和藥物安全性評價具有重要意義。
NRK-52E(大鼠腎細胞)
NRK-52E(大鼠腎細胞)培養(yǎng)操作步驟
1.細胞復(fù)蘇：
(1)將凍存管從液氮中取出，快速放入37°C水浴鍋中，輕搖凍存管使之溶解；
(2)溶解后把細胞懸液轉(zhuǎn)移到含有5 ml培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細胞，室溫1000 rpm離心3 min，棄上清；
(3)加入新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液接種到含6-8 ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中輕輕吹打混勻，37°
C、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2.細胞傳代（以T25瓶為例）：
（1）貼壁細胞
細胞匯合度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
a.吸出原培養(yǎng)液；
b.加入3 ml左右不含鈣、鎂離子的PBS，輕輕晃動培養(yǎng)瓶潤洗細胞，吸出PBS丟棄；
c.加入1 ml左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），輕輕晃動培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細胞；
d.置于37°C培養(yǎng)箱消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），顯微鏡下看到細胞明顯變圓，有間隙時可終止，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；
e.加入3 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打混勻后吸出，細胞盡量呈單細胞懸液；
f.將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫1000 rpm離心3分鐘，棄去上清液；
g.加入2 ml新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細胞即可。首次傳代將細胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8 ml新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:3~1:4的比例進行。
（2）懸浮細胞
懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。一般情況下細胞密度維持在1×105~1×106個/ml（不同細胞對密度要求不同），首次傳代將細胞懸液按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8 ml新鮮的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:4的比例進行。
3.細胞凍存：
收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；
(1)細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中1000 rpm離心3-5 min，棄去上清；
(2)加入細胞凍存液（30%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+60%FBS+10%DMSO）重懸細胞，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml，將懸液加入到凍存管中；
(3)將凍存管放入梯度凍存盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中長期保存。
應(yīng)用[4][5]
NRK-52E(大鼠腎細胞)可以用于基于高尿酸誘導(dǎo)的NRK-52E細胞模型探討ZAG對EMT標志物和MAPK信號通路相關(guān)分子的影響
探索高尿酸環(huán)境誘導(dǎo)下的NRK-52E(大鼠腎細胞)中鋅α2糖蛋白(zinc-α2-glycoprotein,ZAG)對上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)標志物以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路相關(guān)分子的影響,為高尿酸血癥腎病的分子機制提供新的思路。
方法:將NRK-52E(大鼠腎細胞)分為正常對照組和高尿酸誘導(dǎo)組(20mg/d L濃度尿酸刺激48h),每組中的細胞都分別進行ZAG的過表達轉(zhuǎn)染和敲低,觀察細胞中ZAG的表達水平對EMT標志物和MAPK信號通路相關(guān)分子的影響。
結(jié)果:在高尿酸干預(yù)后NRK-52E中ZAG mRNA和蛋白質(zhì)表達量明顯升高(P<0.01;P<0.0001);相較于正常培養(yǎng)組,高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下的NRK-52E(大鼠腎細胞)中EMT標志物波形蛋白(vimentin)和層粘連蛋白(laminin)mRNA及蛋白質(zhì)的表達均升高(P<0.05);在高尿酸環(huán)境培養(yǎng)下,上調(diào)ZAG會減少大鼠腎細胞在MAPK通路中MAPK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellularsignal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen activated protein kinase,p38-MAPK)、活化轉(zhuǎn)錄因子2(activated transcription factor-2,ATF2)及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or Akt)mRNA的表達量(P<0.01),而ZAG的下調(diào)則會增加上述基因的表達量(P<0.05)。在NRK-52E(大鼠腎細胞)蛋白質(zhì)層面上,相較于未轉(zhuǎn)染組,ZAG上調(diào)組的MAPK、p38和Akt表達量降低(P<0.05、P<0.01、P<0.0001);ZAG下調(diào)組的ERK1/2、p38和Akt表達量升高(P<0.0001、P<0.05、P<0.01)。
參考文獻
[1]Estradiol Ameliorates Acute Kidney Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting the TGF-βRI-SMAD Pathway[J].Ren Lian;Li Fang;Di Ziyang;Xiong Yan;Zhang Shichen;Ma Qing;Bian Xiaoen;Lang Zhiquan;Ye Qifa;Wang Yanfeng.Frontiers in Immunology.2022
[2]Association between Serum Uric Acid and Impaired Endothelial Function:The Circulatory Risk in Communities Study.[J].Tang Jingyun;Liu Keyang;Eshak Ehab S;Cui Renzhe;Sakaniwa Ryoto;Imano Hironori;Dong JiaYi;Iso Hiroyasu.Journal of atherosclerosis and thrombosis.2021
[3]Molecular Biological and Clinical Understanding of the Pathophysiology and Treatments of Hyperuricemia and Its Association with Metabolic Syndrome,Cardiovascular Diseases and Chronic Kidney Disease[J].Yanai Hidekatsu;Adachi Hiroki;Hakoshima Mariko;Katsuyama Hisayuki.International Journal of Molecular Sciences.2021
[4]Study of Endothelial Dysfunction by Flow Mediated Vasodilation in Individuals with Asymptomatic Hyperuricemia.[J].Shukla Vaibhav;Fatima Jalees;Varshney Ankit Raj;Joshi Prerit;Kugashiya Ruman.The Journal of the Association of Physicians of India.2021
[5]陳柄源.基于高尿酸誘導(dǎo)的NRK-52E細胞模型探討ZAG對EMT標志物和MAPK信號通路相關(guān)分子的影響[D].右江民族醫(yī)學(xué)院,2024.