背景[1-6]
GV3101(pSoup)Electro感受態(tài)細胞是以為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。
pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup即為GV3101(pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開發(fā)的GV3101(pSoup)電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pGs2-ZH(卡那霉素抗性)質(zhì)粒(size:40 kd)檢測轉(zhuǎn)化效率可達5×103 cfu/μg DNA。
GV3101(pSoup)Electro感受態(tài)細胞操作方法
1.0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5μg質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒體積不大于6ul，用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3.啟動電轉(zhuǎn)儀，設置參數(shù)：C=25μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
注意事項：如-80冰箱儲存過程中沒有發(fā)生凍融的情況，是可以用來轉(zhuǎn)化的，但是由于凍存時間過長，轉(zhuǎn)化效率會有所下降，如果用于普通的質(zhì)粒重轉(zhuǎn)或TA克隆等高效連接體系也是可以的，如珍貴的樣品請選用較為新鮮的感受態(tài)細胞。
應用[7][8]
GV3101(pSoup)Electro感受態(tài)細胞可用于組織遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的研究：
以農(nóng)桿菌菌株GV3101和LBA4404、質(zhì)粒pCAMBIA1301、牡丹品種’鳳丹白’試管苗葉柄誘導形成的愈傷組織為供試材料,進行了農(nóng)桿菌表達載體的轉(zhuǎn)化和牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究。試驗獲得了轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404,進一步將GUS基因轉(zhuǎn)入牡丹愈傷組織,于共培養(yǎng)后成功檢測到GUS瞬時表達活性。同時對經(jīng)篩選培養(yǎng)后得到的轉(zhuǎn)化愈傷組織進行了GUS組織化學檢測,成功檢測到GUS活性的表達。
主要結果及結論如下:1農(nóng)桿菌表達載體的轉(zhuǎn)化及菌株的篩選試驗進行了質(zhì)粒pCAMBIA1301 DNA的提取、農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404感受態(tài)的制備、質(zhì)粒DNA對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化等一系列工作,成功的將質(zhì)粒pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中,獲得了含有GUS標記基因的農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404的表達載體。通過兩個菌株侵染牡丹愈傷組織的一系列試驗,結果表明,菌種GV3101自身毒性較強,抑菌較為困難,侵染愈傷后對牡丹愈傷生活力傷害較大,GUS組織化學染色后愈傷開始變紅,且染色時間較長。
LBA4404屬于弱毒性菌種,侵染后對牡丹愈傷生活力沒有明顯影響,且有較高的轉(zhuǎn)化效率。因此確定菌株LBA4404為適宜牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的菌種。2選擇性抗生素的確定試驗對常用的選擇性抗生素Kan和Hyg進行篩選,分別試驗牡丹愈傷組織對其的敏感性。牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步構建本試驗通過農(nóng)桿菌介導的方法,最終選用農(nóng)桿菌菌株LBA4404對牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系進行初步的研究。
對遺傳轉(zhuǎn)化過程中影響轉(zhuǎn)化率的各項影響因子(預培養(yǎng)時間、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間及溫度等)的最適條件進行了初步篩選,并初步建立以細菌的植物組織培養(yǎng)基懸浮液侵染法的牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系:挑取LBA4404單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中,置于搖床28℃環(huán)境中220rpm振蕩培養(yǎng)過夜,將菌液室溫4000rpm離心10min,棄上清,用植物液體培養(yǎng)基W0重懸菌體至OD600=0.6。
將繼代后的牡丹愈傷組織切至0.2X 0.2cm大小,不經(jīng)過預培養(yǎng),直接用OD600=0.6的菌液侵染20min,將侵染后的愈傷置于濾紙上晾干后,接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基,在22℃黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)3d。隨后用200mg·l-1Cef水涮洗浸泡愈傷30min,盡量洗凈殘留菌體,后接入含有100mg·I-1Cef的液體增殖培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)24h,隨后將愈傷取出,經(jīng)無菌水涮洗后置于濾紙上晾干,接至含有1OOmg·l-1Cef和3mg·l-1Hyg的固體篩選培養(yǎng)基中,20d轉(zhuǎn)接一次。
參考文獻
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[8]申萍.牡丹愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的初步研究[D].河南農(nóng)業(yè)大學,2014.