背景^[1-7]

AGL1 Electro感受態(tài)細胞是以為C58,RecA型背景，核基因中含有篩選標簽—利福平抗性基因rif和羧芐青霉素抗性基因carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的琥珀堿型Ti質(zhì)粒pTiBo542DT-DNA，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pTiBo542DT-DNA質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移）。

AGL1菌株適用于水稻、擬南芥、楊樹等植物的轉(zhuǎn)基因操作。唯地生物開發(fā)的AGL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒(size:11633bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質(zhì)粒(size:40kd)檢測轉(zhuǎn)化效率可達5×103 cfu/μg DNA。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細胞中分別含有Ti(Tumour inducing)質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中，并且可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)。

選擇一種特制的空質(zhì)粒載體（如PBI121質(zhì)粒載體），其上要求含有T-DNA邊界序列（此處可參見詞條雙元表達載體系統(tǒng)），在序列之間含有復制原點、抗性基因、GUS報告基因、HindⅢ和BamH I等酶切位點（以上這些構(gòu)成了一個T-DNA區(qū)）。先通過雙酶切反應酶切空質(zhì)粒載體和目的基因，再通過酶連反應連接空質(zhì)粒載體和目的基因，從而構(gòu)建成完整的重組質(zhì)粒。

此時重組質(zhì)粒的T-DNA區(qū)包括T-DNA邊界序列、復制原點、突變啟動子片段、GUS報告基因、抗性基因。我們稱這段T-DNA區(qū)為目的片段。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理是構(gòu)建雙元表達載體系統(tǒng)，由兩種質(zhì)粒組成，一種是位于大腸桿菌中的穿梭質(zhì)粒，另一種是位于農(nóng)桿菌中的輔助性質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中后，用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌去侵染植物根部切口，通過輔助性質(zhì)粒的Vir區(qū)表達蛋白與重組質(zhì)粒T-DNA區(qū)（目的片段）的反式作用激活T-DNA的轉(zhuǎn)移（此處可參見詞條雙元表達載體系統(tǒng)），從而將目的片段整合到植物細胞基因組中。隨著愈傷組織的形成，使得新生細胞均含有該目的片段的基因。

應用^[7][8]

AGL1 Electro感受態(tài)細胞可用于DNA插入突變及生長代謝突變子分析的研究：

瑞氏木霉(Trichoderma reesei，anamorph；Hypocrea jecorina)是具有重要經(jīng)濟價值的工業(yè)絲狀真菌，可以用于生產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多種酶類，這些酶類已廣泛應用于紡織、造紙、制漿等工業(yè)領(lǐng)域。同時，由于具有很強的蛋白分泌能力，該菌已被開發(fā)成為表達同源蛋白和異源蛋白的良好真核宿主。多樣化的代謝能力、對人沒有毒性以及生長快、無性繁殖等競爭性生長是瑞氏木霉的重要特征。

目前，瑞氏木霉全基因組測序工作已經(jīng)完成，這對深入了解這個經(jīng)濟重要的工業(yè)菌株具有重大意義，同時也為鑒定那些與該菌生長、代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因提供了良好平臺。利用分子標簽技術(shù)獲得突變體己成為進行基因克隆和遺傳學分析最有效的方法之一。因此，建立瑞氏木霉基因標簽的插入突變體庫是功能基因組學發(fā)展的趨勢，而對不同表型突變體的正、反向遺傳學分析可以促進揭示瑞氏木霉生長、代謝的分子機理。

研究的目的在于建立和優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，利用T-DNA隨機插入突變建立瑞氏木霉的突變體庫；采用反向遺傳學和正向遺傳學方法相結(jié)合的策略對突變株進行變異性狀的分析和基因水平的研究，鑒定那些與突變性狀相關(guān)的新基因；選擇那些控制瑞氏木霉生長、發(fā)育或重要代謝途徑的關(guān)鍵基因發(fā)生插入突變的突變株進行生理、生化和分子遺傳學的研究，深入了解基因的功能和闡明相關(guān)的分子機理。

1．農(nóng)桿菌介導的瑞氏木霉轉(zhuǎn)化及T-DNA插入突變分析本文用農(nóng)桿菌AGL1成功介導轉(zhuǎn)化了絲狀真菌瑞氏木霉QM9414，T-DNA隨機插入到瑞氏木霉染色體中，并得到了一批瑞氏木霉T-DNA插入突變體。將pAN7-1質(zhì)粒的HPH基因表達盒插入到Ti質(zhì)粒pBI121中，獲得了雙元載體pBI-hph。該載體導入農(nóng)桿菌AGL1后，在乙酰丁香酮的誘導下，瑞氏木霉原生質(zhì)體或孢子與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)產(chǎn)生了具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率較高，并篩選到了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。

從隨機挑選的9個轉(zhuǎn)化子的PCR和雜交分子驗證表明，T-DNA上的HPH基因已插入到瑞氏木霉染色體中。借助于TAIL-PCR方法，從轉(zhuǎn)化子中成功克隆到了T-DNA插入位點側(cè)翼序列，序列分析證明T-DNA是隨機插入到瑞氏木霉染色體中的。

參考文獻

[1]Agrobacterium-mediated transformation(AMT)of Trichoderma reesei as an efficient tool for random insertional mutagenesis[J].Yao Hua Zhong,Xiao Li Wang,Tian Hong Wang,Qiao Jiang.Applied Microbiology and Biotechnology.2007(6)

[2]Sequential gene deletions in Hypocrea jecorina using a single blaster cassette[J].Lukas Hartl,Bernhard Seiboth.Current Genetics.2005(3)

[3]Agrobacterium-mediated transformation as a tool for functional genomics in fungi[J].Caroline B.Michielse,Paul J.J.Hooykaas,Cees A.M.J.J.Hondel,Arthur F.J.Ram.Current Genetics.2005(1)

[4]Proteomic response of the biological control fungus Trichoderma atroviride to growth on the cell walls of Rhizoctonia solani[J].Jasmine Grinyer,Sybille Hunt,Matthew McKay,Ben R.Herbert,Helena Nevalainen.Current Genetics.2005(6)

[5]Development of a system for integrative and stable transformation of the zygomycete Rhizopus oryzae by Agrobacterium-mediated DNA transfer[J].C.B.Michielse,K.Salim,P.Ragas,A.F.J.Ram,B.Kudla,B.Jarry,P.J.Punt,C.A.M.J.J.Hondel.Molecular Genetics and Genomics.2004(4)

[6]Agrobacterium-mediated insertional mutagenesis(AIM)of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J].Andreas Leclerque,Hong Wan,Anette Abschütz,Siwei Chen,Galina V.Mitina,Gisbert Zimmermann,Hans Ulrich Schairer.Current Genetics.2004(2)

[7]Cloning and targeted disruption,via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,of a trypsin protease gene from the vascular wilt fungus Verticillium dahliae[J].Katherine F.Dobinson,Sandra J.Grant,Seogchan Kang.Current Genetics.2004(2)

[8]鐘耀華.農(nóng)桿菌介導的瑞氏木霉T-DNA插入突變及生長代謝突變子分析[D].山東大學,2007.