背景[1-6]
MaxUp mRNA建庫試劑盒是針對Illumina高通量測序平臺專門研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建試劑盒MaxUp mRNA建庫試劑盒cDNA二鏈合成模塊配有兩種buffer，可根據(jù)需要進行常規(guī)建庫或鏈特異性建庫。本產(chǎn)品適用于起始模板為10 ng-1μg不同來源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過mRNA分離、片段化、鏈雙鏈cDNA合成、末端修復(fù)、加A尾、接頭連接和文庫擴增，總RNA樣品zui終轉(zhuǎn)化為適用于Illumina平臺測序的文庫。
試劑盒包含三個獨立模塊，BOX-I的核心為純化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成所需的所有試劑。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板，實現(xiàn)鏈特異性。
提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證，zui大程度上保證了文庫構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性。MaxUp mRNA建庫試劑盒適用于起始模板量為10-1000 ng（體積≤50μL）的高質(zhì)量動物、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低，體積超過50μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠進行濃縮。RNA需通過Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測，RIN值要求＞7，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。
MaxUp mRNA建庫試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo d(T)磁珠，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提?。黄渌痪遬oly(A)尾的mRNA，如非編碼RNA、無poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴重，通常無完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，故亦無法使用本試劑盒進行建庫。
文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）
1.通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。
2.文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit、PicoGreen等；基于qPCR定量的方法。
3.推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
4.文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop等。
5.文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設(shè)備進行檢測。
應(yīng)用[7][8]
MaxUp mRNA建庫試劑盒所制備文庫可進行多種RNA-Seq應(yīng)用，包括：
基因表達（gene expression）
單核苷酸變異檢測（single nucleotide variation discovery）
基因融合鑒定（gene fusion identification）
剪切變異體分析（splice variant analysis）
通過新一代測序技術(shù)(Next generation sequencing,NGS),對垂體ACTH腺瘤全轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序,在轉(zhuǎn)錄組水平篩選相關(guān)差異表達基因和microRNA;并與患者臨床表型進行關(guān)聯(lián)分析,探究垂體ACTH腺瘤所致臨床表型的分子機理,此外,考慮到血清游離miRNA具有作為腫瘤標志物的潛力,篩選差異表達的血清miRNA,并對差異表達的血清miRNA進行了驗證,為深入研究庫欣病的發(fā)病機制,篩選診斷標志物提供依據(jù)。
以期最終實現(xiàn)垂體腺瘤患者個性化治療。垂體腺瘤是常見的顱內(nèi)良性腫瘤之一,發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤第二位,約占顱內(nèi)腫瘤的10%-15%,并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。隨著腫瘤不斷生長,可壓迫蝶鞍區(qū)周圍結(jié)構(gòu),如視神經(jīng)、海綿竇、腦底動脈、下丘腦等,甚至累及額葉、腦干,而導(dǎo)致嚴重的功能障礙。同時,腫瘤生長還可導(dǎo)致垂體激素分泌紊亂。
按照外周血激素水平,垂體腺瘤分為無功能型垂體腺瘤(NFPA)和功能型垂體腺瘤,包括：泌乳素腺瘤(PRL)、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(Cushing)、生長激素腺瘤(GH)、促甲狀腺激素腺瘤(TSH)、促性腺激素腺瘤(PGA)以及混合激素分泌腺瘤等。其中垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(ACTH-PAs)臨床又稱為庫欣病(Cushing’s Disease)是一種伴有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌的功能型垂體腺瘤約占全部垂體腺瘤的14%,約占庫欣綜合征(Cushing’s syndrome)的70%。
參考文獻
[1]Expression pattern of the Hedgehog signaling pathway in pituitary adenomas[J].Maria P.Yavropoulou,Anna Maladaki,Konstantina Topouridou,Vasiliki Kotoula,Chris Poulios,Emily Daskalaki,Nikolaos Foroglou,George Karkavelas,John G.Yovos.Neuroscience Letters.2015
[2]Identification and characterization of tumor suppressor and oncogenicmiRNAs in gastric cancer[J].Zhaofeng Chen,Xiaoguang Liu,Zenan Hu,Yuping Wang,Min Liu,Xiaojun Liu,Hailong Li,Rui Ji,Qinhong Guo,Yongning Zhou.Oncology Letters.2015(1)
[3]Downregulation of Insulin-like growth factor binding protein 6 is associated with ACTH-secreting pituitary adenoma growth[J].Yakun Yang,Miaomiao Sheng,Fengming Huang,Dechao Bu,Xiaohai Liu,Yong Yao,Congxin Dai,Bowen Sun,Jindong Zhu,Yonghui Jiao,Zhenqing Wei,Huijuan Zhu,Lin Lu,Yi Zhao,Chengyu Jiang,Renzhi Wang.Pituitary.2014(6)
[4]Acromegaly:An Endocrine Society Clinical Practice Guideline[J].Laurence Katznelson,Edward R.Laws,Shlomo Melmed,Mark E.Molitch,Mohammad Hassan Murad,Andrea Utz,John A.H.Wass.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2014(11)
[5]MicroRNA expression profile of bromocriptine-resistant prolactinomas[J].Zhe Bao Wu,Wei Qiang Li,Shao Jian Lin,Cheng De Wang,Lin Cai,Jiang Long Lu,Yun Xiang Chen,Zhi Peng Su,Han Bing Shang,Wen Lei Yang,Wei Guo Zhao.Molecular and Cellular Endocrinology.2014(1-2)
[6]Detection of recurrent Cushing’s disease:proposal for standardized patient monitoring following transsphenoidal surgery[J].Alejandro Ayala,Alex J.Manzano.Journal of Neuro-Oncology.2014(2)
[7]MicroRNAs as Biomarkers in Pituitary Tumors[J].Antonio Di Ieva,Henriett Butz,Marzia Niamah,Fabio Rotondo,Salvatore De Rosa,Aydin Sav,George M.Yousef,Kalman Kovacs,Michael D.Cusimano.Neurosurgery.2014(2)
[8]孫博文.基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序的垂體ACTH腺瘤mRNA及microRNA表達譜分析[D].北京協(xié)和醫(yī)學院,2016.