T3 RNA聚合酶（T3 RNA Polymerase）是一種來源于T3噬菌體的DNA依賴型RNA聚合酶，因其對特定啟動子序列的高度專一性和高效的轉(zhuǎn)錄能力，已成為分子生物學(xué)研究中一種核心工具酶。T3 RNA聚合酶分子量約100 kDa，屬于DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase）。它是一個功能強大的分子生物學(xué)工具。其核心價值在于高特異性與強正交性，能與T7、SP6等系統(tǒng)在多基因表達或復(fù)雜遺傳線路構(gòu)建中并行使用。同時，其標記核苷酸高效摻入能力，也使其成為制備高靈敏度RNA探針的理想選擇。
基本特性
T3 RNA聚合酶通過基因工程手段在大腸桿菌（E. coli）中重組表達獲得，保證其高產(chǎn)量和純度。以含有T3啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以四種核糖核苷三磷酸（ATP、UTP、GTP、CTP）為底物，催化RNA鏈按5'→3' 方向合成。高度專一地識別T3噬菌體特有的23 bp保守啟動子序列，這使其與T7、SP6等系統(tǒng)互不干擾?？筛咝饺肷锼?、地高辛、熒光素等標記的核苷酸，用于制備各類標記RNA探針。在70℃加熱10分鐘或加入EDTA能使其失活。
動子識別與轉(zhuǎn)錄特性
T3 RNA聚合酶高度專一地識別T3噬菌體的特定啟動子序列。該啟動子的23 bp保守序列在不同啟動子間高度保守，且其序列與T7啟動子非常相似。識別核心：T3 RNA聚合酶對其啟動子序列具有極高的特異性，嚴格區(qū)分于T7等異源啟動子，這確保了轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的正交性。關(guān)鍵結(jié)構(gòu)差異：決定其特異性的關(guān)鍵差異主要集中在啟動子序列中至位附近。共識序列：T3啟動子的共識序列為：AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA。加粗的G（+1位）是轉(zhuǎn)錄的起始核苷酸。轉(zhuǎn)錄起始位點（+1位）至+3位的堿基對轉(zhuǎn)錄效率至關(guān)重要，+1位必須是G，+2位和+3位必須為嘌呤堿基（A或G）。體外轉(zhuǎn)錄：在體外，T3 RNA聚合酶能高效轉(zhuǎn)錄T3基因組，其動力學(xué)特性顯示，酶活性對底物GTP的濃度有較高依賴性。
T3 RNA聚合酶的核心應(yīng)用
一、體外轉(zhuǎn)錄合成RNA，這是其最核心的用途。能以線性化質(zhì)粒為模板，在體外高效合成大量未標記或標記的RNA，用于下游各類實驗。
二、制備RNA探針，通過摻入放射性或非放射性標記的NTP，制備高比活度的RNA探針，用于Northern blot、Southern blot和原位雜交等。
三、生產(chǎn)功能性RNA分子，高效合成反義RNA（asRNA）、小干擾RNA（siRNA）和用于體外翻譯的mRNA等。
四、研究RNA結(jié)構(gòu)與功能，為RNA剪接、RNA二級結(jié)構(gòu)、RNA-蛋白質(zhì)相互作用等研究提供RNA底物。
五、基因調(diào)控與功能研究，利用合成的反義RNA在細胞內(nèi)特異性抑制靶基因表達，用于基因功能研究。
六、高通量RNA合成，由于其單亞基結(jié)構(gòu)簡單，易與自動化平臺整合，可用于規(guī)?；?、高通量RNA合成。
注意事項
模板準備：用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板必須是線性化的。應(yīng)在目的基因下游的T3啟動子后選擇合適的限制性內(nèi)切酶，將環(huán)狀質(zhì)粒完全切開。
反應(yīng)體系：使用供應(yīng)商提供的配套反應(yīng)緩沖液。典型的反應(yīng)體系包含線性化DNA模板、NTPs、RNase抑制劑和T3 RNA聚合酶。通常37℃孵育1-2小時即可獲得高產(chǎn)量的RNA。
RNase污染：RNA極易被環(huán)境中無處不在的RNase降解。實驗全程需使用無RNase的耗材和試劑，并建議在體系中加入RNase抑制劑。
T3 RNA聚合酶的改造
目前以 T3 RNA聚合酶為基礎(chǔ)，為優(yōu)化其性能，出現(xiàn)了更多改進型的生物技術(shù)方法。其中在《一種多用途RNA靶分子的制備方法》的專利中，選取待測RNA病毒對應(yīng)的特定DNA目的片段，計包含 T7 及 T3 啟動子序列的引物，在目的片段正鏈的 5'端 加上 T7 啟動子序列，在負鏈的 5'端 加上 T3 啟動子序列（或者也可以加 T7 啟動子序列），人工合成上述含有啟動子序列的DNA片段，并以此為模板，利用 T7 和/或 T3 啟動子的引物序列進行 PCR擴增，獲得大量的雙鏈DNA分子。最后用以上述獲得的DNA產(chǎn)物為模板，利用 T7 RNA聚合酶 和/或 T3 RNA聚合酶 進行轉(zhuǎn)錄擴增，最終獲得單鏈或雙鏈的 RNA靶分子[1]。
該方法可以在短時間內(nèi)獲得大量的特異性RNA靶分子片段。操作簡便， 流程標準化。用途廣泛， 制備的RNA靶分子可用于相關(guān)的檢測或研究（如作為核酸檢測的陽性對照等）。
參考文獻
[1] 宜昌美光硅谷生命科技股份有限公司. 一種多用途RNA靶分子的制備方法：CN 116463396 A.2023.07.21.