PFU DNA POLYMERASE 是一種來(lái)源于超嗜熱古菌Pyrococcus furiosus的DNA聚合酶，屬于B家族DNA聚合酶。與廣泛使用的Taq DNA聚合酶相比，PFU DNA POLYMERASE 最顯著的特征在于其具有3'→5'外切核酸酶活性，能夠在DNA合成過(guò)程中識(shí)別并切除錯(cuò)誤摻入的堿基，從而顯著降低PCR擴(kuò)增的突變率。有研究表明，PFU DNA POLYMERASE 在PCR反應(yīng)中的突變率僅為2.6%，是所有熱穩(wěn)定聚合酶中最精確的聚合酶之一。在分子生物學(xué)研究中，PFU DNA POLYMERASE 廣泛應(yīng)用于對(duì)保真度要求極高的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，包括基因克隆、定點(diǎn)突變、DNA測(cè)序和全基因合成等。

PFU DNA POLYMERASE 表達(dá)宿主的選擇

PFU DNA POLYMERASE 基因來(lái)源于嗜熱古菌，其DNA序列中A/T含量較高，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)可能面臨稀有密碼子不足的問(wèn)題。采用實(shí)驗(yàn)室保藏的含PFU DNA POLYMERASE 基因重組質(zhì)粒的菌株，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化獲得了高產(chǎn)量的PFU DNA POLYMERASE ^[1]。而另一研究則系統(tǒng)比較了BL21(DE3)與Rosetta(DE3)兩種宿主對(duì)PFU DNA POLYMERASE 表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示，Rosetta(DE3)菌株由于能夠補(bǔ)充稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，其PFU DNA POLYMERASE 的表達(dá)量顯著高于BL21(DE3)系統(tǒng)，從400 mL培養(yǎng)液中可獲得約30 mg純化后的PFU DNA POLYMERASE ^[2]。相比之下，在BL21(DE3)中相同培養(yǎng)規(guī)模的PFU DNA POLYMERASE 產(chǎn)量?jī)H為6 mg左右。因此，對(duì)于PFU DNA POLYMERASE 的高效表達(dá)，Rosetta(DE3)是更為理想的宿主菌株^[2]。

優(yōu)勢(shì)與局限

PFU DNA POLYMERASE 最核心的優(yōu)勢(shì)是其高保真性，非常適用于對(duì)序列準(zhǔn)確性要求極高的實(shí)驗(yàn)。其次是耐熱性高，比Taq酶更穩(wěn)定，在95°C孵育1小時(shí)后仍能保持90%以上的活性，允許將變性溫度提高至98°C以處理GC含量高的模板。但是PFU DNA POLYMERASE 也有其局限性，首先就是延伸速度慢，Pfu的擴(kuò)增效率較低，其典型延伸速度僅為每分鐘500至1000個(gè)堿基。相比之下，Phusion高保真DNA聚合酶的處理能力比Pfu高10倍。另外因其3'→5'外切酶校正活性，Pfu酶在室溫下可能從3'端降解引物，使用時(shí)需特別注意。還有就是Pfu擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平末端，無(wú)3'端“A”突出，不能直接使用常規(guī)的TA克隆，需使用平末端克隆載體或?qū)Ξa(chǎn)物進(jìn)行加A處理。

參考文獻(xiàn)

[1] 歐陽(yáng)樂(lè)軍, 李莉梅, 布梁灝, 等. Pfu DNA聚合酶的表達(dá)條件優(yōu)化及純化研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(12): 5458-5464.

[2] 何華華, 胡曉韻, 王婷, 等. Pfu DNA聚合酶在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的表達(dá)及快速純化[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 41(3): 223-227.