100bp DNA梯度指示帶（100bp DNA Ladder）是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中不可或缺的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，廣泛應(yīng)用于基因片段大小鑒定、細(xì)胞凋亡檢測(cè)等研究領(lǐng)域。它由一系列已知長(zhǎng)度的DNA片段組成，范圍通常覆蓋100bp至1000bp或1500bp，能夠?yàn)檠芯咳藛T提供精確的DNA片段大小參考。無(wú)論是PCR產(chǎn)物的鑒定、限制性酶切分析，還是細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA斷裂的檢測(cè)，都離不開(kāi)100bp DNA梯度指示帶的輔助。

制備技術(shù)

目前，制備100bp DNA梯度指示帶主要有兩種技術(shù)路線，限制性內(nèi)切酶法和PCR擴(kuò)增法。酶切法是通過(guò)使用特定限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA，獲得一系列長(zhǎng)度不同的DNA片段^[1]。然而，這種方法存在明顯的局限性，酶切位點(diǎn)在DNA上的分布往往不均勻，導(dǎo)致獲得的片段之間間隔不規(guī)律，同時(shí)，操作流程繁瑣，涉及細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取、酶切純化等多個(gè)步驟，周期較長(zhǎng)。相比之下，PCR擴(kuò)增法制備100bp DNA梯度指示帶具有顯著優(yōu)勢(shì)。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，可以直接擴(kuò)增出100bp、200bp、300bp直至1000bp的目標(biāo)片段，然后將純化后的產(chǎn)物按比例混合即可使用^[1]。

100bp DNA梯度指示帶在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的核心應(yīng)用

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要生理過(guò)程，其特征性生化改變之一是基因組DNA被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解，產(chǎn)生180-200bp整數(shù)倍的DNA片段。將這些片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)典型的“階梯狀”條帶，即DNA Ladder現(xiàn)象。在這一檢測(cè)過(guò)程中，100bp DNA梯度指示帶作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)揮著極其重要的“標(biāo)尺”作用。

研究者利用100bp DNA梯度指示帶，系統(tǒng)分析了茶多酚誘導(dǎo)卵巢癌COC1細(xì)胞凋亡的效果^[2]。將不同濃度（250、500、1000、2000、4000μg/mL）的茶多酚分別處理COC1細(xì)胞24小時(shí)，提取基因組DNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并以100bp DNA梯度指示帶作為分子量參照。結(jié)果顯示：低濃度（≤500μg/mL）茶多酚處理主要誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，中等濃度（2000μg/mL）處理可觀察到明顯的晚期凋亡現(xiàn)象，而過(guò)高濃度（4000μg/mL）則導(dǎo)致細(xì)胞壞死。更重要的是，經(jīng)不同濃度茶多酚處理的所有COC1細(xì)胞均檢測(cè)到DNA Ladder現(xiàn)象，且隨著茶多酚濃度升高，DNA降解程度加重，DNA梯狀條帶愈發(fā)明顯^[2]。這一研究充分說(shuō)明，100bp DNA梯度指示帶對(duì)于判斷凋亡引起的DNA片段大小分布具有關(guān)鍵作用，通過(guò)將樣品條帶與100bp DNA梯度指示帶中各參考條帶進(jìn)行比對(duì)，研究人員可以明確判斷DNA斷裂片段是否呈現(xiàn)典型的180-200bp倍增模式，從而確認(rèn)凋亡的發(fā)生。

100bp DNA梯度指示帶的應(yīng)用不僅局限于動(dòng)物細(xì)胞，在植物細(xì)胞凋亡研究中也同樣重要。研究者采用100bp DNA梯度指示帶分析了土荊芥揮發(fā)油對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的化感潛力^[3]。通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取土荊芥揮發(fā)油，以不同劑量（5、10、15、20μL）處理蠶豆根尖細(xì)胞不同時(shí)間（24、48、72小時(shí)），提取總DNA后進(jìn)行電泳分析，并以100bp DNA梯度指示帶作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明：較高劑量（≥15μL）的揮發(fā)油處理48小時(shí)和72小時(shí)后，能夠誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞發(fā)生凋亡，電泳圖上可以清晰觀察到DNA片段化形成的梯狀條帶，且這種效應(yīng)呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性^[3]。該研究再次證明，100bp DNA梯度指示帶是判斷植物細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA斷裂特征的重要工具，通過(guò)比對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品與100bp DNA梯度指示帶的條帶位置，可以精確確定所檢測(cè)DNA片段的大小范圍，從而為凋亡判斷提供分子水平的直接證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 王俐, 董衛(wèi)華, 張俊河, 王天云. DNA Ladder的制備[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(24): 4493-4496.

[2] 張思楠, 伍春蓮, 陳楊瓊, 等. 茶多酚誘導(dǎo)卵巢癌COC1細(xì)胞凋亡的研究[J]. 西華師范大學(xué)學(xué)報(bào)( 自然科學(xué)版), 2011, 32(2): 141-145.

[3] 胡琬君, 馬丹煒, 王亞男, 等. 土荊芥揮發(fā)油對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞的化感潛力[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(13): 3684-3690.