土木香( Inula helenium L.)為菊科旋覆花屬多年生草本植物。主產(chǎn)于河北,此外,浙江、四川、河南、山西、陜西、甘肅及新疆等地亦產(chǎn)。其根供藥用,具有健脾和胃,調(diào)氣解郁,止痛安胎的功效,用于胸脅、脘腹脹痛,嘔吐瀉痢,胸脅挫傷,岔氣作痛,胎動不安?，F(xiàn)代藥理證明其揮發(fā)油中有效成分土木香內(nèi)酯(alantolactone)具有較好的驅(qū)蟲作用、抗菌作用、對心血管有興奮和抑制作用,異土木香內(nèi)酯(isoalantolactone)也具有較好的驅(qū)蟲作用。已有關(guān)于土木香中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯分離的報道。筆者是利用土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯雙鍵位置不同,與Ag+形成配合物的牢固程度不同,可以將兩種成分分開。故采用Ag+絡(luò)合柱層析法從土木香的丙酮可溶部分分離得到兩個單一晶體成分,根據(jù)其理化常數(shù)及光譜數(shù)據(jù)分析,分別鑒定為alantolac-tone(Ⅰ)和isoalantolactone(Ⅱ)。研究發(fā)現(xiàn),丙酮對土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的提取效果要優(yōu)于石油醚,同時,此工藝易于進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[3]。GC法
(1)色譜條件 色譜柱：載體，Chromsorb W-HP (80～100目);固定液，3%FFAP(聚乙二醇2mol/L和2-硝基苯甲酸的反應(yīng)物);(2m×2mm)不銹鋼柱;柱溫：158℃;進樣器溫度;200℃;檢測器：FID;載氣：N2流速30ml/min;H2流速0.6ml/min;空氣壓力：49.03kPa。
(2)對照品及內(nèi)標溶液的配制 精密稱取對照品11.11mg，置于1ml量瓶中，加氯仿溶解，制成標準對照品儲備液。另精密稱取二十三烷5.7mg，置1ml量瓶中，加氯仿至刻度，為內(nèi)標儲備液。
(3)校正因子測定 用100μl微量注射器吸取標準對照品儲備液160μl置于1ml量瓶中，再于量瓶中加入100μl內(nèi)標儲備液，加氯仿至刻度，混勻，取1μl注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，用峰面積計算校正因子。
(4)樣品溶液的制備 取土木香藥材粉末約1g，精密稱定，置具塞瓶中，準確加入氯仿3ml，冷浸過夜，取濾液適量，加內(nèi)標溶液120μl，氯仿定容至1ml，作為樣品溶液。
(5)測定 吸取樣品溶液1μl，注入氣相色譜儀，按內(nèi)標法計算藥材中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的百分含量。
(6) 色譜圖


圖1 對照品及內(nèi)標物的氣相色譜圖
1.內(nèi)標物，tR=6min; 2.土木香內(nèi)酯，tR=13min; 3.異土木香內(nèi)酯，tR=19min
【對多發(fā)性骨髓瘤 RPMI-8226 細胞增殖、凋亡的影響】[2]
使用濃度為 1、2． 5、5、7． 5 及 10 μmol/L 的土木香內(nèi)酯處理 RPMI-8226 細胞 48 h，應(yīng)用 CCK-8檢測細胞活力，并計算其半數(shù)抑制濃度( IC50) 值; 使用濃度為 2． 5，5 及 7． 5 μmol/L 的土木香內(nèi)酯處理 RPMI-8226細胞 48 h 后，應(yīng)用 Annexin V/PI 雙標記法分析細胞凋亡; Western blot 方法檢測呈切割的 caspase-3 及 ERK 信號通路的變化; 裸鼠荷瘤并給予土木香內(nèi)酯以進一步驗證其對多發(fā)性骨髓瘤細胞的促凋亡作用。發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯可抑制 RPMI-8226 細胞活力，并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)( r = － 0． 9784，P = 0． 0007) ; RPMI-8226 細胞 48 h 的 IC50為 4． 32 ±0. 15 μmol / L; 流式細胞術(shù)分析凋亡結(jié)果顯示，隨著土木香內(nèi)酯濃度的增高，細胞早期凋亡率顯著增加( r = 0． 9601，P＜ 0． 05) ; Western blot 結(jié)果顯示，土木香內(nèi)酯處理 RPMI-8226 細胞后，活化了 caspase-3，降低 ERK 磷酸化水平; 體內(nèi)結(jié)果顯示，給藥組小鼠瘤體積明顯小于對照組( P ＜ 0． 05) ; 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組瘤內(nèi)細胞核增殖相關(guān)抗原 Ki67 及 p-ERK 的水平降低。結(jié)論: 土木香內(nèi)酯可有效地抑制多發(fā)性骨髓瘤 RPMI-8226 細胞增殖并促進其凋亡，其機制可能是通過抑制 ERK 信號通路的活性，抑制裸鼠皮下多發(fā)性骨髓瘤的生長。
已有研究發(fā)現(xiàn)，土木香內(nèi)酯具有多種抗腫瘤的效果。本研究選擇多發(fā)性骨髓瘤 RPMI-8226 細胞作為研究對象，通過體外和體內(nèi)兩方面研究土木香內(nèi)酯對多發(fā)性骨髓瘤的抗腫瘤作用。首先應(yīng)用CCK-8 檢測土木香內(nèi)酯對 RPMI-8226 細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)其可以顯著的抑制骨髓瘤的細胞活性，48 hIC50為 4． 32 ± 0． 15 μmol/L。此前，Mi 等報道人正常干細胞株 L02 對土木香內(nèi)酯較不敏感，其 IC50約為 31． 34 μg /ml( 133．75 μmol/L) 。由此可見，土木香內(nèi)酯對正常細胞殺傷力較低，而在較低的濃度下對骨髓瘤細胞殺傷效果明顯。進一步的流式細胞術(shù)檢測土木香內(nèi)酯處理骨髓瘤細胞后發(fā)現(xiàn)，土木香內(nèi)酯通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗骨髓瘤的作用。土木香片50 kg,用丙酮滲漉提取四次。回收溶劑后得淡黃色油狀物,置于- 5℃下靜置過夜,結(jié)晶,過濾后得淡黃色針狀結(jié)晶250 kg(Ⅰ、Ⅱ的混合物)。取此結(jié)晶100 g,經(jīng)氧化鋁-硝酸銀柱層析、硅膠-硝酸銀柱層析反復(fù)分離,用石油醚-苯-乙酸乙酯混合溶劑洗脫,薄層層析檢測,收集薄層斑點相同部分合并。將薄層檢測為Ⅰ部分回收溶劑后用少量乙酸乙酯熱溶解,然后加入大量石油醚得結(jié)晶Ⅰ(16 g),將薄層檢測為Ⅱ部分回收溶劑后用乙酸乙酯重結(jié)晶得Ⅱ(20 g)。
    土木香作為藥效明確的傳統(tǒng)中藥,近年來已在成藥處方中替代含馬兜鈴酸的青木香使用,其揮發(fā)油中有效成分土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的研究也日益受到關(guān)注。利用丙酮滲漉,經(jīng)氧化鋁-硝酸銀柱層析、硅膠-硝酸銀柱層析反復(fù)分離,得到土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯純品。此方法產(chǎn)品產(chǎn)量高,操作簡單,可以用于土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的大規(guī)模生產(chǎn)工藝。由于硝酸銀見光易分解,故在此生產(chǎn)工藝過程中應(yīng)采取避光措施。[1]孫文基,謝世昌 主編;趙曄,張興群,陳千良等 編.天然藥物成分定量分析.北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2003.第12-13頁.
[2]姚瑤,孫月月,夏丹丹,牛銘山,趙愷,李振宇,曾令宇,徐開林. 土木香內(nèi)酯對RPMI-8226細胞的增殖抑制作用及其相關(guān)機制研究[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志,2015,23(05):1336-1340.
[3]劉國宇,李靜,王新莉,周軍輝,王答祺. 土木香中土木香內(nèi)酯與異土木香內(nèi)酯的分離鑒定[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,57(04):9-10.易溶于乙醇、氯仿、苯、乙醚和油, 幾乎不溶于水。 來源于菊科植物土木香 Inula helenium L. 根, 大旋復(fù)花 Inula grandis chrenk 葉。用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。
藥理藥效:1. 驅(qū)蟲: 作用與山道年類似 。對豬蛔蟲、貓寄生蟲亦有驅(qū)蟲作用 。2. 抗菌: 體外實驗證明, 在0.1μg/ml 濃度時能抑制結(jié)核桿菌的生長。服給藥能延緩感染人型結(jié)核桿菌的豚鼠的發(fā)病, 但不能完全制止。此外, 還有很強的抗真菌作用。3. 其它: 低濃度藥物能興奮離體蛙心, 較高濃度則抑制并使其停止于舒張期。蛙后肢及兔耳血管灌流時, 低濃度藥物有輕微擴張作用, 高濃度則收縮。對動物的血壓、呼吸等亦有一定影響。