雙抗體夾心法本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)的含量。小鼠本試劑盒應(yīng)采用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)水平。用純化的基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)，再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)含量。1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。 3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。可檢測(cè)樣本中小鼠的MMP-8，且與其類(lèi)似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP-8），又名中性粒細(xì)胞膠原酶或PMNL膠原酶，是一種存在于大多數(shù)哺乳動(dòng)物結(jié)締組織中的膠原裂解酶，由MMP8基因編碼，該基因是一簇MMP基因的一部分，這些基因定位于染色體11q22.3。多種物質(zhì)，如IL-1、IL-8、TNF-α和GM-CSF，可刺激中性粒細(xì)胞釋放MMP-8，后者是啟動(dòng)ECM分解的關(guān)鍵酶。它的主要功能是I型，II型和III型膠原蛋白的降解?；罨乃闪呀馓烊坏鞍兹缋w連蛋白、軟骨蛋白聚糖、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白和多肽。它通過(guò)預(yù)防淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來(lái)影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為，強(qiáng)調(diào)藥物開(kāi)發(fā)中抗目標(biāo)識(shí)別的重要性。它通過(guò)消除炎癥參與創(chuàng)面修復(fù)，為治療創(chuàng)面愈合不良的新策略開(kāi)發(fā)提供一定的可能性。它也在先天免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起作用。