本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠VCAM-1/CD106抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的大鼠VCAM-1/CD106會(huì)與包被抗體結(jié)合。后依次加入生物素化的抗大鼠VCAM-1/CD106抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，抗大鼠VCAM-1/CD106抗體與結(jié)合在包被抗體上的大鼠VCAM-1/CD106結(jié)合，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值，VCAM-1/CD106濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中VCAM-1/CD106的濃度。本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1/CD106)的含量。1、組織標(biāo)本 對(duì)于樣本要求保持鮮重，稱取樣本中的重量不小于50mg，一般以1g為基準(zhǔn),但不嚴(yán)格要求固定樣本每個(gè)重量必須達(dá)到相同的水平。勻漿的比例選取10%，相當(dāng)于1g組織加9ml的勻漿液來進(jìn)行勻漿。勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）。勻漿過程選用組織勻漿器，冰浴上勻漿。(或者進(jìn)行液氮碾磨)，離心取上清，離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)每分，時(shí)間是15分鐘。取上清液待檢。 2-1、貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。 2-2超聲波破碎條件：用20kHz頻率，150W的功率，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，每破碎2s，間隔3s，反復(fù)破碎三次。 2-3反復(fù)凍融：收集細(xì)胞懸液，4℃低溫離心（3000rpm，5min），棄上清，加入一定量PBS（200ul），輕輕吹打混勻，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍，如此反復(fù)3次，可形成細(xì)胞裂解液。 3、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融. 4、不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。 3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。 4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。 5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。 7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。 8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。 9. 測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。