貼壁細(xì)胞是指在體外培養(yǎng)中附著在培養(yǎng)容器底部或壁上的細(xì)胞。當(dāng)這些細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度，或者為了進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)時(shí)，就需要對(duì)其進(jìn)行消化傳代，胰蛋白酶在這個(gè)過程中扮演著關(guān)鍵的角色。今天小編就給大家盤點(diǎn)下它在貼壁細(xì)胞傳代中的注意事項(xiàng)~

貼壁細(xì)胞的傳代

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿后需要將其稀釋分種成多瓶，細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)，這一過程也叫「?jìng)鞔?/span>。當(dāng)貼壁細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且匯合度達(dá)到80%時(shí)，即可傳代。

胰蛋白酶的作用原理

胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)是肽鏈的Lys或Arg兩個(gè)殘基的羧基端肽鏈，通過在特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上與培養(yǎng)皿壁結(jié)合處蛋白降解，從而使兩者分離。這時(shí)，細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力可成為球形。

貼壁細(xì)胞傳代中如何使用胰蛋白酶

胰蛋白酶在貼壁細(xì)胞傳代的過程中被用來水解細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從而減弱細(xì)胞與培養(yǎng)容器或其他細(xì)胞的黏附力。下面是使用其進(jìn)行貼壁細(xì)胞傳代的一般步驟：

1.檢查細(xì)胞狀態(tài)：在進(jìn)行傳代前，首先要在顯微鏡下檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，確保它們已經(jīng)達(dá)到適宜傳代的生長(zhǎng)階段。

2.清洗細(xì)胞：先將瓶中的培養(yǎng)基棄掉，并用生理鹽水或1×PBS清洗2-3次，以最大限度地清除瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的殘留（培養(yǎng)基中所含的胎牛血清對(duì)胰蛋白酶的消化起抑制作用）。

3.加入胰蛋白酶溶液：加入少量消化液，蓋過細(xì)胞即可。胰蛋白酶作用于賴氨酸或精氨酸的C末端，在37°C具有最佳的效率。將培養(yǎng)瓶放入溫箱中處于37°C孵育（孵育的時(shí)間因細(xì)胞特性的變化而變化，并沒有固定的時(shí)間），消化程度通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)即可進(jìn)行判斷。

4.監(jiān)控細(xì)胞分離：在顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞會(huì)皺縮變圓，此時(shí)則視為消化完畢；或者用移液器吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。如果發(fā)現(xiàn)消化不足，可加入胰蛋白酶消化液重新消化。

圖1 貼壁細(xì)胞消化前（左）和消化后（右）

（圖源于網(wǎng)絡(luò)）

5.停止胰蛋白酶作用：一旦細(xì)胞分離，應(yīng)立即加入含有血清的培養(yǎng)基來終止胰蛋白酶的消化作用，以防止消化過度對(duì)細(xì)胞造成不可逆損傷。使用重組胰蛋白酶則無(wú)需血清終止。

6.收集和分散細(xì)胞：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，并通過離心來分離細(xì)胞。丟棄上清液，加培養(yǎng)液并用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

如何選擇合適的胰蛋白酶 

不同的細(xì)胞加入胰蛋白酶的成分和濃度不一樣，不能一味的選擇消化能力強(qiáng)的胰蛋白酶，否則會(huì)消化過度，損傷細(xì)胞。

貼壁不牢和半貼壁細(xì)胞：盡量使用濃度0.05%不含EDTA的胰蛋白酶且不需要放在培養(yǎng)箱孵育，這樣易于控制，對(duì)細(xì)胞的傷害也降到最低。

貼壁性較強(qiáng)的細(xì)胞：需要使用含EDTA的0.25%的胰蛋白酶，消化細(xì)胞時(shí)間不宜過長(zhǎng)。

在細(xì)胞培養(yǎng)中，EDTA常常用來螯合鈣離子和鎂離子，這對(duì)于阻斷某些離子依賴性的細(xì)胞黏附過程非常重要。與胰蛋白酶一同使用，幫助分離貼壁細(xì)胞。

酚紅在不同pH值下會(huì)呈現(xiàn)不同顏色，因此通過觀察培養(yǎng)基的顏色，研究人員可以直觀地判斷培養(yǎng)環(huán)境的pH是否處于適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍。

重組胰蛋白酶具有與動(dòng)物源性相同的酶學(xué)性質(zhì)，但不含任何動(dòng)物源成分，可替代胰蛋白酶使用，消化后可通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋降低活性，無(wú)需血清終止。之前發(fā)布的文章中提到過，重組胰蛋白酶無(wú)外源性病毒污染，而采用傳統(tǒng)提取的酶可能存在支原體等污染，由于其酶蛋白活性不穩(wěn)定，還會(huì)影響到細(xì)胞消化的結(jié)果。

金普諾安|重組胰蛋白酶 

金普諾安重組胰蛋白酶是由微生物基因重組表達(dá)生產(chǎn)，氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶一致，且具有與動(dòng)物源性豬胰蛋白酶相同的酶學(xué)性質(zhì)，可替代豬胰腺來源胰蛋白酶應(yīng)用于各種生物技術(shù)過程中，如：重組胰島素生產(chǎn)、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞發(fā)酵、蛋白質(zhì)的酶解以及各種組織的細(xì)胞分離等。胰蛋白酶活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑如PMSF等的抑制，金屬離子螯合劑如EDTA等也能抑制酶活。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

無(wú)動(dòng)物源性：重組生產(chǎn)，無(wú)外源性的病毒污染，不使用任何動(dòng)物源原料;

質(zhì)量穩(wěn)定：產(chǎn)品批次間無(wú)差異，可保證穩(wěn)定連續(xù)的批次生產(chǎn)；

純度高：比活高；

宿主蛋白殘留小于生物制品限度要求；

凍干粉：易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸；

符合法規(guī)要求：生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境符合相關(guān)法規(guī)要求，生產(chǎn)過程遵循 ISO9001:2015 質(zhì)量體系。

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注意事項(xiàng)

1.為何細(xì)胞難以脫離培養(yǎng)瓶？

A：可能是胰蛋白酶活力不足或者使用的濃度較低，也可能是高匯合度和酶不能進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)的界面，以及未清洗的細(xì)胞內(nèi)含有血清抑制了胰酶活性?？墒褂眯迈r批次和最佳濃度的酶，或徹底清洗移除血清，或在低細(xì)胞濃度時(shí)解離細(xì)胞。

2.什么時(shí)候表示消化好了？

A：并不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才表示消化結(jié)束，一般肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙狀移動(dòng)就可以了，這時(shí)就應(yīng)該停止消化。

——文中部分插圖源自攝圖網(wǎng)，已獲授權(quán)