【技術(shù)原理】

多重免疫組化，主要的技術(shù)原理來自TSA技術(shù)，TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。 TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合，經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團(tuán)，結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。

簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯(lián)熒光素），來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。
然后微波處理，前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉，共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個(gè)一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。

【技術(shù)優(yōu)勢】

• 1.由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔(dān)心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)不同種屬抗體選擇匹配的限制。
• 2.TSA技術(shù)可以用于檢測用傳統(tǒng)方法無法檢出的低豐度靶標(biāo)。基于酪酰胺的信號放大技術(shù)能夠提供極強(qiáng)的敏感度、檢測極微量的目的抗原。極大的降低抗體的用量，節(jié)約抗體，實(shí)測確實(shí)可以顯著提升抗體的稀釋比例。
• 3. 熒光法多重免疫組化，可同時(shí)進(jìn)行五個(gè)顏色通道以上，這種情況下發(fā)射光譜會重疊，我們可以借助多光譜成像系統(tǒng)來解決這個(gè)問題。這是傳統(tǒng)間接熒光法染色和顯色法多重免疫組化所做不到的。這種方法能真實(shí)反映關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況和相互之間的關(guān)系，從而極大地節(jié)約珍貴的樣品。

【愛必信多色服務(wù)】

* 我們可以提供的服務(wù)：
最多四指標(biāo)五色（含DAPI）的多色免疫組化服務(wù)，樣本涵蓋人、小鼠、大鼠的石蠟切片及組織芯片（TMA），并提供全片掃描和區(qū)域分析。

* 我們可以提供的服務(wù)結(jié)果：

1.全片200X（相當(dāng)于物鏡20X，目鏡10X）原圖，提供看圖軟件可在客戶端打開。數(shù)據(jù)上傳網(wǎng)盤1G以內(nèi)，或用U盤寄送1G以上。
2.客戶指定區(qū)域的單細(xì)胞分析結(jié)果：

• 單陽性細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比，密度。
• 雙陽性或3陽性細(xì)胞占有核細(xì)胞百分比，密度。
• 組織面積和特定病理形態(tài)面積計(jì)算。
• TMA提供每個(gè)芯點(diǎn)的以上定量結(jié)果，并提供熱圖。

* 我們驗(yàn)證的過的抗體列表（已優(yōu)化過條件，無需您再提供一抗，不在此列表的指標(biāo)需要您提供一抗，我們預(yù)實(shí)驗(yàn)先行驗(yàn)證，更新指標(biāo)可定期咨詢銷售）

【結(jié)果案例展示】

1.人 T細(xì)胞活化狀態(tài)檢測 CD3 CD69 HLA-DR

2.類器官體外檢測、腫瘤標(biāo)志物檢測

3.同源小鼠腫瘤PD實(shí)驗(yàn)

【代表文獻(xiàn)（精選）】

黑色素瘤組織,CD8,PD1,S100,Sox10,PD-1藥物抗性及病人復(fù)發(fā)機(jī)制
Zaretsky, J. M., et al. (2016). "Mutations Associated with Acquired Re-sistance to PD-1 Blockade in Melanoma." N Engl J Med 375(9): 819-29. IF 59.558

Merkel細(xì)胞癌組織,NSE,CD8,CD68,PD1,PD-L1綜合分析免疫治療前后腫瘤組織微環(huán)境狀態(tài)變化
Nghiem, P. T., et al. (2016). "PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Ad-vanced Merkel-Cell Carcinoma." N Engl J Med 374(26): 2542-52. IF 59.558

胰腺癌.Snail,Twist, Snail 對EMT（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）的影響
Nature. 2015 November 26; 527(7579): 525–530. doi:10.1038/nature16064.

肝癌組織,CD3,CD68,肝癌免疫景觀分析決定PD-L1異質(zhì)性與治療敏感性
中山大學(xué)鄭利民教授 The Journal of Clinical Investigation,J Clin Invest. 2019.