帕金森?。≒D）是一種常見于中老年人群的慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其核心病理特征為黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元的選擇性進(jìn)行性丟失，導(dǎo)致紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著降低。該病在臨床上主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)癥狀（如靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙）和非運(yùn)動(dòng)癥狀兩大類。近年來，非運(yùn)動(dòng)癥狀如疼痛、抑郁、焦慮、認(rèn)知功能障礙等日益受到關(guān)注，因其發(fā)生率高（疼痛和抑郁的發(fā)生率可達(dá)40%-85%），且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但目前的治療手段尚不能有效緩解這些癥狀。建立能夠同時(shí)模擬PD運(yùn)動(dòng)與非運(yùn)動(dòng)癥狀的穩(wěn)定動(dòng)物模型，對(duì)于深入揭示PD的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

帕金森病的臨床表現(xiàn)、病理生理學(xué)及診斷成像^[1]

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本方案基于 6-羥基多巴胺（6-OHDA）單側(cè)損毀紋狀體構(gòu)建PD小鼠模型，可穩(wěn)定誘導(dǎo)模型小鼠出現(xiàn)痛敏反應(yīng)及抑郁樣行為等非運(yùn)動(dòng)癥狀，同時(shí)可伴隨經(jīng)典運(yùn)動(dòng)功能障礙，適用于 PD 非運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)病機(jī)制研究、潛在治療靶點(diǎn)篩選等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)象為 C57BL/6 小鼠，整體操作包含實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、動(dòng)物建模、行為學(xué)檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析四大核心環(huán)節(jié)，具體操作如下。

一、實(shí)驗(yàn)核心準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)

動(dòng)物品系：7 周齡 SPF 級(jí)雄性 C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量(22±2)g，無特定病原體感染，雌雄選擇為雄性以減少生理周期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫恒濕環(huán)境，采用 12h 光 / 暗循環(huán)光照模式，食物和水自由攝??；小鼠購(gòu)入后先適應(yīng)飼養(yǎng) 1 周，再開展后續(xù)建模操作，減少環(huán)境應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

動(dòng)物分組：隨機(jī)分為對(duì)照組（注射生理鹽水）和模型組（注射 6-OHDA），參考實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組 8 只、模型組 7 只，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求適當(dāng)調(diào)整樣本量，保證組間均衡。

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（二）主要試劑與儀器

核心試劑：2.5g/L 6-OHDA（abs42070403）、生理鹽水、地昔帕明、紅霉素軟膏

地昔帕明用于術(shù)前腹腔注射，抑制外周單胺氧化酶，減少 6-OHDA 在外周的降解，提高建模效率。

關(guān)鍵儀器：立體定位框架、注射泵、Von Frey 纖維絲、行為分析系統(tǒng)（SMART V3.0）、異氟烷麻醉機(jī)、加熱墊、鉆孔器、高速攝像機(jī)，以及用于機(jī)械痛、懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的專用測(cè)試箱 / 容器。

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二、6-OHDA 誘導(dǎo) PD 小鼠模型構(gòu)建（單側(cè)紋狀體注射法）

（一）術(shù)前預(yù)處理

建模手術(shù)前 30min，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射地昔帕明，劑量為 25mg/kg，注射后將小鼠置于安靜環(huán)境，等待麻醉操作。

（二）麻醉與固定

采用異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行吸入麻醉，待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其固定于立體定位框架上，術(shù)中持續(xù)給予異氟烷維持麻醉深度，避免小鼠蘇醒。

手術(shù)過程中，將小鼠放置于加熱墊上，維持其體溫穩(wěn)定；同時(shí)將紅霉素軟膏涂抹于小鼠眼部，防止長(zhǎng)時(shí)間光照造成眼損傷。

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（三）手術(shù)操作（左側(cè)紋狀體定位與注射）

術(shù)區(qū)準(zhǔn)備：剃除小鼠頭部手術(shù)部位毛發(fā)，用無菌剪刀做切口，充分暴露前后囟，為腦區(qū)定位做準(zhǔn)備。

腦區(qū)定位：以小鼠前囟為原點(diǎn)，進(jìn)行前后、左右調(diào)平，確定左側(cè)紋狀體坐標(biāo)：內(nèi)側(cè) / 外側(cè)（M/L）：-1.8mm；前 / 后（A/P）：+0.4mm；背 / 腹（D/V）：-3.5mm。

鉆孔與注射：用鉆孔器在定位點(diǎn)處鉆孔，將連接注射泵的微量注射器置入左側(cè)紋狀體區(qū)，分別向?qū)φ战M、模型組注射 2μL 生理鹽水、2.5g/L 6-OHDA（abs42070403），注射流量控制為 0.5nL/s，保證試劑緩慢、均勻注入。

術(shù)后處理：注射完成后，停針 10min，防止試劑回流，隨后緩慢退出注射器；對(duì)手術(shù)切口進(jìn)行無菌處理，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，待其自然蘇醒，術(shù)后持續(xù)觀察小鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水情況，確保其正常存活。

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（四）建模后恢復(fù)期

建模手術(shù)完成后，將小鼠放回標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)行 2 周的恢復(fù)期飼養(yǎng)，期間保證環(huán)境安靜，減少外界刺激，待 2 周后開展行為學(xué)檢測(cè)，驗(yàn)證模型構(gòu)建效果。

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三、模型有效性驗(yàn)證（行為學(xué)檢測(cè)）

建模后 2 周，依次進(jìn)行機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)小鼠痛敏反應(yīng)和抑郁樣行為，所有實(shí)驗(yàn)操作前，均將小鼠置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng) 30min，減少環(huán)境應(yīng)激對(duì)行為學(xué)結(jié)果的干擾。

（一）機(jī)械痛實(shí)驗(yàn)（Von Frey 纖維絲法）

實(shí)驗(yàn)裝置：放置有金屬網(wǎng)格的專用測(cè)試箱，不同強(qiáng)度的 Von Frey 纖維絲。

操作方法：將小鼠置于測(cè)試箱中，從 1g 強(qiáng)度開始，采用 Up-down 法，用纖維絲垂直刺激小鼠左后爪中部，刺激程度以纖維絲彎曲成 S 形為準(zhǔn)，每次持續(xù)刺激 5s，每只小鼠共刺激 5 次。

結(jié)果判定：計(jì)算小鼠50% 后爪回撤閾值，模型組小鼠該閾值顯著低于對(duì)照組（t=6.854，P<0.001），表明模型小鼠出現(xiàn)痛敏反應(yīng)，建模后痛覺過敏特征顯著。

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（二）懸尾實(shí)驗(yàn)（檢測(cè)抑郁樣行為）

實(shí)驗(yàn)裝置：離地 30cm 的懸尾裝置，行為分析系統(tǒng)（SMART V3.0），高速攝像機(jī)。

操作方法：將小鼠尾巴固定于懸尾裝置，使小鼠呈尾巴朝上、頭部朝下的倒立姿勢(shì)，用攝像機(jī)和行為分析系統(tǒng)記錄 6min 小鼠行為。

結(jié)果判定：統(tǒng)計(jì)小鼠不動(dòng)時(shí)間百分比，小鼠出現(xiàn)持續(xù)不動(dòng)狀態(tài)判定為 “行為絕望狀態(tài)”，模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間百分比顯著高于對(duì)照組（t=3.828，P<0.05），表明模型小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為。

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（三）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（驗(yàn)證抑郁樣行為）

實(shí)驗(yàn)裝置：高 30cm 的透明容器，行為分析系統(tǒng)（SMART V3.0），高速攝像機(jī)，水溫控制裝置。

操作方法：向透明容器內(nèi)加入℃的水，將小鼠放入容器中，用攝像機(jī)和行為分析系統(tǒng)記錄 6min 小鼠行為，當(dāng)小鼠持續(xù)不動(dòng)超過 2s 時(shí)，記錄其不動(dòng)時(shí)間。

結(jié)果判定：計(jì)算小鼠6min 內(nèi)不動(dòng)時(shí)間百分比，模型組小鼠該指標(biāo)顯著高于對(duì)照組（t=2.958，P<0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證模型小鼠存在抑郁樣行為。

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四、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

分析軟件：采用 GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，保證數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性和專業(yè)性。

數(shù)據(jù)表示：所有計(jì)量資料以xˉ±s（均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差）形式表示，直觀反映數(shù)據(jù)的集中趨勢(shì)和離散程度。

檢驗(yàn)方法：對(duì)照組與模型組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.001為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

模型判定標(biāo)準(zhǔn)：若模型組小鼠 50% 后爪回撤閾值顯著降低，且懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間百分比均顯著升高，即表明 6-OHDA 單側(cè)紋狀體注射誘導(dǎo)的 PD 小鼠模型構(gòu)建成功。

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五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)與關(guān)鍵要點(diǎn)

6-OHDA 使用：6-OHDA 為兒茶酚胺類神經(jīng)毒素，操作時(shí)需做好防護(hù)；試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，避免放置時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致藥效降低，注射劑量精準(zhǔn)控制為 5μg（2μL×2.5g/L），該低劑量可穩(wěn)定誘導(dǎo)非運(yùn)動(dòng)癥狀，減少小鼠死亡率。

立體定位精度：紋狀體定位的坐標(biāo)精準(zhǔn)性是建模成功的關(guān)鍵，操作時(shí)需嚴(yán)格按照 M/L：-1.8mm、A/P：+0.4mm、D/V：-3.5mm 定位，避免腦區(qū)偏差導(dǎo)致建模失敗。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)一致性：所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)需由同一實(shí)驗(yàn)人員在同一時(shí)間、同一環(huán)境下完成，減少人為和環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾；實(shí)驗(yàn)過程中保持環(huán)境安靜，避免外界刺激影響小鼠行為。

動(dòng)物福利與存活：術(shù)后密切觀察小鼠狀態(tài)，及時(shí)處理術(shù)后感染等問題；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，給予充足的食物和水，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

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六、模型應(yīng)用與延伸

模型特征：本模型通過單側(cè)紋狀體注射低劑量 6-OHDA，可穩(wěn)定誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)機(jī)械痛敏反應(yīng)和抑郁樣行為，同時(shí)可伴隨 PD 經(jīng)典運(yùn)動(dòng)功能障礙，貼合臨床 PD 患者除運(yùn)動(dòng)癥狀外，常合并疼痛、抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀的病理特征。

適用研究：適用于 PD 疼痛、抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀的神經(jīng)機(jī)制研究，以及針對(duì) PD 非運(yùn)動(dòng)癥狀的藥物、基因、物理治療等潛在治療靶點(diǎn)的篩選和驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)延伸：可在本模型基礎(chǔ)上，增加認(rèn)知功能、焦慮樣行為等其他非運(yùn)動(dòng)癥狀的檢測(cè)，或結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，探究紋狀體、海馬、黑質(zhì)等腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺、5 - 羥色胺）、炎性因子、信號(hào)通路（PI3K/Akt/mTOR）等與 PD 非運(yùn)動(dòng)癥狀的關(guān)聯(lián)。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Haider, Achi et al. “Translational molecular imaging and drug development in Parkinson's disease.” Molecular neurodegeneration vol. 18,1 11. 10 Feb. 2023, doi:10.1186/s13024-023-00600-z
[2] Bonito-Oliva, Alessandra et al. “A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions.” Frontiers in behavioral neuroscience vol. 8 290. 27 Aug. 2014, doi:10.3389/fnbeh.2014.00290
[3] Zhang, Jia-Qi et al. “Dysfunction of subthalamic dopaminergic circuitry contributes to anxiety- and depression-like behaviors in 6-OHDA lesion-induced hemiparkinsonian mice.” Acta pharmacologica Sinica vol. 46,10 (2025): 2622-2636. doi:10.1038/s41401-025-01570-2
[4] 史雅穎,張靜,謝俊霞,等.6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病模型小鼠的疼痛及抑郁樣行為[J].青島大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2025, 61(3):368-370.

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