需要適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間?，溫度低于ELISA推薦的室溫（20-25℃）會(huì)降低抗原抗體結(jié)合速率，延長(zhǎng)孵育可以保證結(jié)合充分，避免結(jié)果偏低。具體調(diào)整方案如下：
1.為什么低溫需要延長(zhǎng)？
抗原抗體結(jié)合是溫度依賴(lài)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程：常規(guī)ELISA推薦的孵育溫度是?20-25℃（室溫）或37℃?，當(dāng)環(huán)境溫度低于20℃時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速率減慢，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)速率會(huì)下降，若按原時(shí)間孵育，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合不充分，最終出現(xiàn)OD值偏低、假陰性結(jié)果。
2.不同孵育步驟的調(diào)整方案
根據(jù)ELISA實(shí)驗(yàn)的不同步驟，調(diào)整幅度不同：
室溫<20℃時(shí)調(diào)整后的時(shí)間
若室溫低于15℃，優(yōu)先選擇37℃孵育1小時(shí)，比延長(zhǎng)室溫孵育效果更好
封閉不充分會(huì)升高背景，可延長(zhǎng)到過(guò)夜（4℃封閉過(guò)夜也可）
若一抗是低親和力抗體，可直接換為4℃孵育過(guò)夜，結(jié)果更穩(wěn)定
二抗?jié)舛纫话爿^高，延長(zhǎng)幅度不需要太大
顯色過(guò)程需要隨時(shí)觀察，避免顯色過(guò)度，不要嚴(yán)格卡時(shí)間
3.特殊情況處理
若室溫低于15℃：不建議單純延長(zhǎng)室溫孵育，低溫會(huì)大幅降低結(jié)合效率，優(yōu)先選擇?37℃孵育箱?完成包被、一抗、二抗孵育，顯色在室溫觀察即可；
若沒(méi)有37℃孵育箱：可直接將所有孵育步驟調(diào)整為4℃過(guò)夜，4℃過(guò)夜孵育結(jié)合更充分，即使溫度低，足夠長(zhǎng)的時(shí)間也能保證反應(yīng)完全，結(jié)果比短時(shí)間室溫低溫孵育更穩(wěn)定；
顯色終止：只要陰性對(duì)照OD正常，目的孔顯色達(dá)到預(yù)期范圍就可以及時(shí)終止，不要為了湊時(shí)間過(guò)度顯色導(dǎo)致背景升高。