? ? ? ? ? ? ???甲砜霉素快速檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

甲砜霉素是一種廣譜抗生素，具有很好的抗菌效果，常用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，然而，甲砜霉素會(huì)造成人的再生障礙性貧血，而且誘發(fā)濃度還沒(méi)有確定，所以目前已經(jīng)禁止在動(dòng)物及食品中使用甲砜霉素。

甲砜霉素快速檢測(cè)試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)，適用于大批量樣品快速檢測(cè)。

【測(cè)定原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物甲砜霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗甲砜霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物甲砜霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物甲砜霉素的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】 ??

規(guī) ?????格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測(cè)時(shí)間： 45min

樣本定量檢測(cè)下限：

腸???衣………………………………………………0.1ppb????????

蜂???蜜………………………………………………0.1ppb

牛???奶………………………………………………0.05ppb

尿液、血清…………………………………………0.1ppb

組織、肝臟……………………………………… 0.025ppb

飼 ??料………………………………………………0.15ppb

細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)液……………………………………1ppb

樣本回收率：

組織、肝臟………………………………………80%±10%

蜂蜜、腸衣………………………………………70%±10%

牛奶、飼料………………………………………85%±15%

尿液、血清………………………………………70%±10%

細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)液…………………………………80±10%　??????????????

交叉反應(yīng)率

甲砜霉素………………………………………… 100%

氟霉素…………………………………………< 0.1%

【試劑盒組成】

1、 微量測(cè)試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標(biāo)記物 ??????7ml……………………???紅色帽

5、 抗體工作液 ??7ml……………………???綠色帽

6、 底物 A 液 ?????7ml……………………??棕色帽

7、 底物 B 液 ?????7 ml…………………… 黑色帽

8、 終 止 液 ???????7 ml…………………… 黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液 ??40ml………………白色帽

10、 2X濃縮復(fù)溶液 ????50ml………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】

具備的儀器：微孔板酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20μl-200μl、100μl-1000μl、多道 250μl

試 ?????劑：乙酸乙酯、乙腈、正己烷、去離子水、亞硝基鐵氰化鈉、硫酸鋅、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、醋酸鈉、醋酸

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、C液（牛奶樣本使用）：

0.36M 亞硝基鐵氰化鈉（Na₂Fe(CN)₅·NO·2H₂O）10.7g 亞硝 基鐵氰化鈉加去離子水100ml溶解。

配液2、D液（牛奶樣本使用）：

1M硫酸鋅（ZnSO₄·7H₂O）28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。

配液3、 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本使用）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。

配液4、乙腈-水溶液 ?V_乙腈：V_H2O＝84：16

配液5、 將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。

配液6、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照

??????????????1：19稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按

?????????????所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】

樣本處理前須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、

禽類(lèi)和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚(yú)、蝦等。

（2）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（3）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）組織、肝臟樣本前處理方法

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；

2、 稱3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；

3、 取出4ml上層液體在氮?dú)饬?/span>50-60℃水浴中干燥；

4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。

5、 取50 μl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5 ????

（b）血清血漿

1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；

2、 靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫4000r/min離心5min；

3、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?/span>50℃水浴中干燥；

4、 殘留物用1 ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s；

5、 取50μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1 ?

（c） 尿液

1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；

2、 加40μl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)（或過(guò)夜）；

3、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；

4、 室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮?dú)庀?/span>50～60℃干燥；

5、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

6、 取50μl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（d）蜂蜜

1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml

去離子水溶解；

2、 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min；

3、 室溫4000r/min以上離心10min；

4、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮?dú)饬飨赂稍铮?/span>

5、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s；

6、 取50 μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5 ??????檢測(cè)下限：0.025ppb

定量下限：0.1 ppb ???

注：我們推薦0.1 ppb為陽(yáng)性樣本的cut off值。

（e）腸衣

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注：干樣本需剪碎（長(zhǎng)度不超5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上(去除表面的鹽份)，瀝干后再進(jìn)行均質(zhì)。

2、 稱1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。

3、 取出5ml上層液體（相當(dāng)于0.5g的樣本）在氮?dú)饬飨?/span>50-60℃干燥。

4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上，離心5min。

5、 去上層相，取下層50 μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（f）牛奶和奶粉

牛奶樣本處理方法一

1、 牛奶樣本，10℃4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪；

2、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150μlC液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150μlD液混合；

3、 15℃4000r/min以上，離心10min，移取上層液；

4、 用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合30s；

5、 取50μl用于分析。

注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過(guò)程。

樣本稀釋倍數(shù)：2 ?????檢測(cè)下限：0.1ppb ??

定量下限：0.15ppb

牛奶樣本處理方法二

1、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中；

2、 加入250μlC液和250μlD液徹底混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如果沒(méi)有冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃；

3、 轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液（相當(dāng)于2ml奶樣）至一

個(gè)新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min；

4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ；

5、 轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于1ml奶樣），60℃氮?dú)饬飨峦耆稍铮?/span>

6、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

7、 取50μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5 ?檢測(cè)下限：0.025ppb

定量檢測(cè)限：0.05ppb

由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽(yáng)性結(jié)果的CUT OFF判斷值。

奶粉樣本處理方法

1、 稱2±0.05 g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解；

2、 加1ml C液和1ml D液徹底混合。4-12℃4000r/min以上離心10min。若無(wú)冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃；

3、 轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液（相當(dāng)于0.6g奶粉）至一

個(gè)新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來(lái)回

振蕩5min；

4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min；

5、 轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于0.4g奶粉），60℃氮?dú)饬飨峦耆稍铮?/span>

6、 用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

7、 取50 μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1 ????檢測(cè)下限：0.05ppb

定量檢測(cè)限：0.15ppb

由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽(yáng)性結(jié)果的CUT OFF判斷值。

（g）蛋類(lèi)

1、 用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；

2、 稱取3±0.05 g均質(zhì)過(guò)的樣本，與9ml乙腈-水溶液（84︰16；V_乙腈︰V_水）振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

3、 取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯混合5min，15℃4000r/min以上離心10min；

4、 將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中50℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

5、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷。

6、 取50 μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2 ????檢測(cè)下限：0.1ppb

定量檢測(cè)限：0.3ppb

（h）飼料

1、 稱取2±0.05g均質(zhì)過(guò)的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取2ml上層有機(jī)相到試管中56℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷。

4、 取50 μl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：3?????檢測(cè)下限：0.15ppb

（i）細(xì)菌/細(xì)胞培養(yǎng)液樣本的處理方法

1、 取50 μl樣本+950 μl配制好的1×復(fù)溶液混合均勻。

2、 取50μl用于分析。

稀釋倍數(shù)：20???

【 酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50μl/孔到各自的微孔中，加入酶標(biāo)記物50μl/孔,然后加入抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50μl，再加底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含甲砜霉素成反比。

1、 粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.05ppb為1.380；0.15ppb為1.100；0.45ppb為0.620；1.35ppb為0.289；4.05ppb為0.108。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb； 樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲砜霉素實(shí)際濃度。

2、 定量分析：

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲砜霉素實(shí)際濃度。若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來(lái)電索取）

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

?

0.05 ???0.15 ?????0.45 ??????1.35 ?????4.05

CAP(ppb) [μg/kg]

圖1： 甲砜霉素檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

3、 再現(xiàn)性：

%CV?

???0 ??????0.05????0.15?????0.45????1.35????4.05

CAP (ppb) [μg/kg]

圖2：甲砜霉素檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出甲砜霉素檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)甲砜霉素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【 注意事項(xiàng)】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、批號(hào)見(jiàn)外包裝。