原代細(xì)胞能夠較好地保留體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域。然而，原代細(xì)胞的增殖能力有限，通常在少數(shù)傳代后便進(jìn)入衰老階段，最終停止增殖，這一現(xiàn)象被稱為“Hayflick極限”。因此，突破這一增殖壽命限制，原代細(xì)胞永生化成為關(guān)鍵技術(shù)途徑。

本期細(xì)胞學(xué)堂將系統(tǒng)解析原代細(xì)胞永生化的分子機(jī)制，并結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)案例，介紹原代細(xì)胞永生化的基本操作思路。

一、原代細(xì)胞永生化的方法

原代細(xì)胞永生化通常利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將外源性永生化基因?qū)肽康脑?xì)胞內(nèi)，從而建立永生化細(xì)胞株。這類永生化細(xì)胞能保留原代細(xì)胞的特性，且具備無限增殖能力。目前，較為常用的策略是SV40大T抗原（TAg）和人端粒酶催化亞基（TERT）介導(dǎo)的永生化。

1、猴腎病毒（SV40）介導(dǎo)的永生化

SV40主要由大T、小T抗原和結(jié)構(gòu)蛋白組成。其中，大T抗原是誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的關(guān)鍵因子。SV40大T抗原片段與p53蛋白及其相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合體導(dǎo)致p53蛋白失活，使抑癌基因失效無法表達(dá)，進(jìn)而阻止細(xì)胞分裂停滯，調(diào)控宿主細(xì)胞周期進(jìn)程，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化。

2、端粒-端粒酶介導(dǎo)的永生化

端粒在維持染色體穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，其長度隨細(xì)胞分裂逐漸縮短，當(dāng)端粒酶長度縮短到臨界值時(shí)，細(xì)胞將會啟動衰老程序，停止增殖。端粒酶催化亞基（TERT）可將RNA反轉(zhuǎn)錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補(bǔ)端粒的長度和染色體的穩(wěn)定性。在正常的真核細(xì)胞中，端粒酶無法有效維持端粒長度，而通過外源導(dǎo)入TERT基因，使細(xì)胞外源表達(dá)TERT，可恢復(fù)端粒酶活性并延長端粒長度，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化。

二、原代細(xì)胞永生化構(gòu)建實(shí)例

本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為靶細(xì)胞，通過293T包裝SV40T慢病毒感染HUVEC，再通過抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)SV40T的永生化HUVEC細(xì)胞株。具體操作流程如下：

慢病毒包裝

1. 將293T細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，待匯合度達(dá)70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

2. 將SV40T表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；

3. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48-72 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；

4. 將上清于4℃，800 rpm離心5 min后，經(jīng)0.45 μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片，獲得慢病毒上清，若病毒液滴度較低，可進(jìn)一步濃縮以提高滴度；

5. 病毒液分裝后放在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

慢病毒感染靶細(xì)胞及篩選

1. 將HUVEC接種至24孔板（接種密度約5×104個(gè)/孔），培養(yǎng)至匯合度50%-60%；

2. 去除舊培養(yǎng)基，加入含病毒液的新鮮培養(yǎng)基；

3. 添加聚凝胺（Polybrene）至終濃度4-8 μg/mL，提高轉(zhuǎn)染效率；

4. 感染6-10 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48 h；

5. 感染48 h后，加入篩選藥物（如1 mg/mL新霉素）；

6. 持續(xù)培養(yǎng)1-2周，每2-3 d更換含篩選藥物的新鮮培養(yǎng)基；

7. 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在藥物壓力下存活，形成穩(wěn)定的抗性克隆并擴(kuò)增。

永生化細(xì)胞鑒定

●基因整合鑒定

提取永生化HUVEC細(xì)胞基因組DNA，通過Sanger測序驗(yàn)證SV40 T基因成功整合至細(xì)胞基因組（圖1）。

圖1. 永生化HUVEC SV40 T基因Sanger測序結(jié)果

●細(xì)胞增殖能力分析

與HUVEC-NC相比，永生化HUVEC（HUVE-SV40 T）呈現(xiàn)更快的增殖速率（圖2）。永生化HUVEC傳至P25代時(shí)，仍維持典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)（圖3）

圖2. HUVEC永生化前后增殖速率

圖3. 永生化HUVEC（P25）形態(tài)觀察

●表型鑒定

永生化HUVEC傳代至P25后，通過免疫熒光檢測其特異性Marker CD31，結(jié)果顯示細(xì)胞純度≥ 90%（圖4）。

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圖4. 永生化HUVEC（P25）免疫熒光鑒定

●功能驗(yàn)證

通過體外成管實(shí)驗(yàn)評價(jià)永生化HUVEC的血管生成能力，結(jié)果表明永生化HUVEC仍具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞成管功能（圖5）。

圖5. 永生化HUVEC體外成管實(shí)驗(yàn)

三、原代細(xì)胞永生化構(gòu)建技術(shù)要點(diǎn)

01、聚凝胺毒性控制

聚凝胺可提高病毒感染效率，但對部分細(xì)胞具有毒性，若細(xì)胞對聚凝胺較為敏感，感染后應(yīng)及時(shí)更換培養(yǎng)液。

02、避免病毒反復(fù)凍融

反復(fù)凍融會降低病毒滴度。建議按照實(shí)驗(yàn)使用量分裝保存。若病毒儲存時(shí)間超過6個(gè)月，使用前應(yīng)重新測定病毒滴度。

03、提高難感染細(xì)胞的感染效率

對于極難感染的細(xì)胞，如DC（樹突狀細(xì)胞）等，可采用多次感染策略，即感染24 h后，更換新鮮病毒進(jìn)行二次感染。

04、永生化細(xì)胞功能驗(yàn)證

永生化原代細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢（如無限增殖、穩(wěn)定性高），但也可能限制其在某些研究中的應(yīng)用。因此，需通過表型和功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

05、傳代質(zhì)量控制

永生化細(xì)胞長期傳代中遺傳不穩(wěn)定可能導(dǎo)致細(xì)胞積累突變，影響其表型和功能。因此，應(yīng)定期評估細(xì)胞狀態(tài)以確保實(shí)驗(yàn)可靠性。

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