從文獻(xiàn)出發(fā)：解讀TSA技術(shù)助力mIHC多重免疫熒光突破檢測(cè)局限
一、多重免疫熒光染色技術(shù)困境與研究方案構(gòu)建
1、免疫染色技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展
免疫組織化學(xué)（IHC）是定位、共定位組織與細(xì)胞內(nèi)抗原的核心技術(shù)，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研與臨床病理診斷。該技術(shù)原理簡(jiǎn)單，但樣本處理中生物大分子易發(fā)生修飾改變，加之組織成分存在個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)流程需反復(fù)優(yōu)化；同時(shí)傳統(tǒng)手工染色受人為操作影響大，結(jié)果重復(fù)性差，難以滿足精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)需求。全自動(dòng)免疫染色系統(tǒng)有效彌補(bǔ)了手工染色的不足，可標(biāo)準(zhǔn)化完成抗原修復(fù)、抗體孵育等關(guān)鍵步驟，降低人為誤差，搭配專用試劑還可同步檢測(cè)蛋白與核酸靶標(biāo)，大幅提升實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性與檢測(cè)效率。
2、自動(dòng)化多重免疫染色技術(shù)瓶頸
但自動(dòng)化免疫染色仍存在明顯短板：主流設(shè)備僅支持1-2種標(biāo)志物同步檢測(cè)，且多依賴色素顯色，多重檢測(cè)時(shí)易出現(xiàn)光譜重疊干擾。免疫熒光（IF）染色依靠不同波長(zhǎng)熒光探針解決了顯色干擾問題，卻依舊受抗體種屬匹配、儀器檢測(cè)精度限制，穩(wěn)定開展多重?zé)晒馊旧y度較大。
酪胺信號(hào)放大技術(shù)（Tyramide Signal Amplification, TSA）是提升免疫檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵技術(shù)，其核心原理為辣根過氧化物酶催化抗原-抗體復(fù)合物周邊酪胺分子大量原位沉積，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的指數(shù)級(jí)放大。該技術(shù)自上世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)后，逐步應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、蛋白免疫印跡等免疫檢測(cè)體系，后續(xù)又拓展至免疫組化、原位雜交實(shí)驗(yàn)中，有效解決了低豐度靶標(biāo)抗原信號(hào)微弱、無法檢出的難題。相較于免疫組化顯色體系，酪胺信號(hào)放大技術(shù)在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中具備獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：該放大方式不會(huì)改變組織內(nèi)靶標(biāo)抗原的相對(duì)表達(dá)量，熒光信號(hào)強(qiáng)度可精準(zhǔn)對(duì)應(yīng)抗原真實(shí)表達(dá)水平，兼顧信號(hào)放大效果與定量檢測(cè)準(zhǔn)確性。因此，將酪胺信號(hào)放大技術(shù)與自動(dòng)化染色平臺(tái)相結(jié)合，有望依托自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)的高重復(fù)性，建立穩(wěn)定可靠的多重免疫熒光染色方案。
3、同種屬抗體多重染色技術(shù)難題
多抗原共定位與共表達(dá)分析是解析細(xì)胞互作、病理機(jī)制、腫瘤微環(huán)境特征的核心研究手段，而穩(wěn)定成熟的多重免疫熒光染色是該類研究的技術(shù)基礎(chǔ)。目前多重?zé)晒馊旧耐ㄓ梅桨笧榇钆洳煌N屬一抗，規(guī)避抗體間交叉反應(yīng)，但市場(chǎng)中靶向特定蛋白的差異化種屬抗體資源十分有限，無法滿足多樣化多靶點(diǎn)檢測(cè)需求。針對(duì)同種屬一抗多重染色的技術(shù)難題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開發(fā)出切片拆分染色圖像疊加、亞型特異性二抗識(shí)別、一抗直接熒光標(biāo)記、表位封閉阻斷非特異性結(jié)合等多種解決方案，但上述方法均無法適配全自動(dòng)染色平臺(tái)，難以兼顧自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化優(yōu)勢(shì)與同種屬抗體多重染色需求。
4、本研究?jī)?nèi)容與方法
為此，本研究將連續(xù)分步染色法與酪胺信號(hào)放大檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，成功搭建適配全自動(dòng)染色平臺(tái)的多重免疫熒光染色體系，突破了傳統(tǒng)自動(dòng)化染色無法使用同種屬一抗開展多靶點(diǎn)檢測(cè)的技術(shù)壁壘。樣本涵蓋人、小鼠福爾馬林及多聚甲醛固定石蠟包埋組織，研究統(tǒng)一組織切片厚度、抗體孵育濃度與孵育時(shí)長(zhǎng)，排除無關(guān)變量干擾，一方面設(shè)置三組不同熒光檢測(cè)體系進(jìn)行平行對(duì)照，直觀對(duì)比TSA放大體系與傳統(tǒng)直接熒光標(biāo)記體系的信號(hào)靈敏度差異；另一方面設(shè)計(jì)多組同源一抗連續(xù)染色方案，搭配TSA技術(shù)專屬的抗原飽和封閉步驟，消除同種屬抗體交叉干擾；同時(shí)依次開展雙標(biāo)、三標(biāo)、四標(biāo)梯度多標(biāo)記染色，驗(yàn)證TSA對(duì)多通道熒光信號(hào)的分辨能力。所有樣本完成染色后統(tǒng)一通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像采集，搭配多組空白對(duì)照、同型對(duì)照，區(qū)分特異性信號(hào)與內(nèi)源背景信號(hào)，全程通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)層層凸顯TSA區(qū)別于傳統(tǒng)熒光檢測(cè)技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
二、信號(hào)靈敏度對(duì)比：TSA大幅提升低豐度靶點(diǎn)檢出能力
為直觀量化TSA相較于傳統(tǒng)熒光檢測(cè)手段的信號(hào)增益效果，研究設(shè)置三組平行檢測(cè)體系開展靈敏度對(duì)照試驗(yàn)，直擊傳統(tǒng)熒光染色低表達(dá)靶點(diǎn)檢測(cè)盲區(qū)。
研究分別采用TSA酪胺放大體系、直接熒光二抗偶聯(lián)體系、鏈霉親和素直標(biāo)熒光體系，檢測(cè)小鼠胚胎血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31。在高表達(dá)CD31的粗大血管中，三種檢測(cè)方法均能檢出清晰信號(hào)，差距并不明顯；但面對(duì)生物體內(nèi)普遍存在的微血管、低表達(dá)靶蛋白區(qū)域，差距被徹底拉開。兩種傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法完全無法捕捉微弱特異性信號(hào)，微血管結(jié)構(gòu)完全被背景熒光淹沒，無法識(shí)別有效陽(yáng)性信號(hào)；而搭載TSA信號(hào)放大的實(shí)驗(yàn)組，依托酶促反應(yīng)在抗原結(jié)合位點(diǎn)聚集大量熒光酪胺分子，讓原本不可見的微弱信號(hào)被高效放大，完整勾勒出細(xì)微微血管網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)各組紅細(xì)胞自發(fā)熒光水平完全一致，說明TSA只針對(duì)性放大特異性靶標(biāo)信號(hào)，不會(huì)提升非特異性背景噪聲，完美兼顧高靈敏度與低背景兩大優(yōu)勢(shì)，這也是所有傳統(tǒng)熒光檢測(cè)體系無法實(shí)現(xiàn)的技術(shù)突破。
三、復(fù)雜免疫組織多標(biāo)檢測(cè)：TSA保障多通道信號(hào)無串?dāng)_
多輪連續(xù)熒光染色極易伴隨信號(hào)衰減與光譜串色，為驗(yàn)證TSA能否規(guī)避這一常見實(shí)驗(yàn)缺陷，研究選取細(xì)胞亞型繁雜、染色難度極高的人脾臟組織開展三標(biāo)免疫熒光檢測(cè)，同步區(qū)分功能不同的T細(xì)胞亞群。
脾臟免疫細(xì)胞亞型復(fù)雜，多標(biāo)染色極易出現(xiàn)信號(hào)重疊、抗體非特異性結(jié)合等問題，研究利用TSA技術(shù)對(duì)人脾臟切片進(jìn)行CD3、CD4、CD8三標(biāo)熒光染色，同步區(qū)分不同T細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，依托TSA分輪次信號(hào)放大模式，三種熒光信號(hào)邊界清晰互不干擾，CD4與CD8陽(yáng)性細(xì)胞空間分布完全分離，可精準(zhǔn)區(qū)分兩類T細(xì)胞亞群，同時(shí)兩類細(xì)胞均與通用T細(xì)胞標(biāo)志物CD3完美共定位。區(qū)別于傳統(tǒng)多標(biāo)熒光染色隨著標(biāo)記數(shù)量增加，信號(hào)逐步衰減、串色愈發(fā)嚴(yán)重的缺陷，TSA每一輪染色都能獨(dú)立完成信號(hào)放大與固定，保證每一種靶標(biāo)信號(hào)都具備充足熒光強(qiáng)度，即便三輪連續(xù)染色后，依舊能維持極高的信號(hào)特異性，證明TSA可以穩(wěn)定支撐復(fù)雜組織的多靶點(diǎn)原位共定位分析。
四、內(nèi)源背景干擾對(duì)照：TSA特異性放大信號(hào)，不放大無效背景
為進(jìn)一步厘清TSA信號(hào)放大的作用機(jī)制，明確其是否會(huì)無差別放大切片整體熒光背景，研究依托小鼠脾臟固有內(nèi)源干擾開展陰性對(duì)照驗(yàn)證，突出TSA靶向放大的獨(dú)特性。
小鼠脾臟內(nèi)漿細(xì)胞自帶大量?jī)?nèi)源免疫球蛋白，會(huì)直接結(jié)合二抗產(chǎn)生固有非特異性背景，這類背景屬于組織本身固有干擾，無法通過染色流程優(yōu)化消除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，即便存在這類固有背景干擾，TSA依舊不會(huì)對(duì)無效的內(nèi)源背景信號(hào)進(jìn)行放大，僅針對(duì)性放大抗原抗體特異性結(jié)合位點(diǎn)的熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)組特異性血管信號(hào)清晰明亮，而非特異性漿細(xì)胞熒光信號(hào)始終維持原有微弱水平，不會(huì)被同步放大加重背景干擾。該結(jié)果證明TSA具備靶向定點(diǎn)放大的核心優(yōu)勢(shì)，不會(huì)無差別放大整張切片所有熒光信號(hào)，最大程度保留了有效信號(hào)與背景信號(hào)的差值，保障染色結(jié)果信噪比始終處于高水平。
五、超高通量四標(biāo)染色：TSA突破多標(biāo)檢測(cè)數(shù)量上限
受制于抗體兼容性與信號(hào)干擾問題，傳統(tǒng)免疫熒光最多實(shí)現(xiàn)三標(biāo)檢測(cè)，且無法使用同種屬一抗，極大限制了腫瘤微環(huán)境多維度分子分析。為突破這一檢測(cè)通量瓶頸，該研究依托TSA技術(shù)，在人腎腫瘤切片中一次性完成四種標(biāo)志物同步檢測(cè)，其中包含三種小鼠同源一抗。借助TSA每輪染色后可徹底滅活上一輪HRP酶活性，阻斷前后輪抗體交叉反應(yīng)，最終四種熒光信號(hào)互不干擾，可清晰區(qū)分腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮、間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、增殖細(xì)胞四類細(xì)胞群，清晰劃分腫瘤與正常組織交界區(qū)域。足以說明TSA徹底打破了傳統(tǒng)熒光染色的兩大桎梏：一是突破抗體種屬限制，同源一抗可自由搭配；二是突破標(biāo)記數(shù)量限制，支持四標(biāo)及以上超高通量多標(biāo)檢測(cè)，大幅提升單張組織切片的檢測(cè)信息量。
六、同源一抗染色驗(yàn)證：TSA徹底消除同種屬抗體交叉反應(yīng)
同種屬一抗交叉反應(yīng)一直是多重免疫熒光實(shí)驗(yàn)的最大痛點(diǎn)，也是限制抗體選擇的關(guān)鍵難題，本部分實(shí)驗(yàn)專門圍繞同源抗體聯(lián)用場(chǎng)景，驗(yàn)證TSA聯(lián)合封閉方案的抗干擾能力。
過往多標(biāo)熒光實(shí)驗(yàn)必須選用不同種屬一抗，一旦使用同種屬抗體，后續(xù)二抗會(huì)無差別結(jié)合所有一抗，造成全面非特異性染色。該研究利用TSA聯(lián)合抗原飽和封閉處理，分別使用3種兔源一抗檢測(cè)小鼠卵巢、2種小鼠源一抗檢測(cè)小鼠肝臟，最終染色結(jié)果無任何交叉結(jié)合現(xiàn)象。單通道獨(dú)立染色信號(hào)與多通道疊加信號(hào)完全吻合，兩種同源抗體不會(huì)互相干擾，染色模式與單標(biāo)染色完全一致。依靠TSA酶促信號(hào)固化作用，每一輪染色完成后抗原位點(diǎn)被徹底封閉，不會(huì)與下一輪同源抗體發(fā)生結(jié)合，徹底解放了抗體選擇限制，這是所有無TSA加持的傳統(tǒng)多標(biāo)染色方法都無法實(shí)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)。
七、復(fù)雜胚胎組織適配性：TSA通用性強(qiáng)，適配各類疑難組織樣本
為全面檢驗(yàn)TSA自動(dòng)化染色體系的普適性，避開結(jié)構(gòu)均一的常規(guī)組織樣本，研究選用結(jié)構(gòu)精細(xì)、細(xì)胞分化復(fù)雜的小鼠胚胎組織開展多組梯度多標(biāo)染色，測(cè)試技術(shù)在疑難樣本中的穩(wěn)定性。
小鼠胚胎組織細(xì)胞分化快、組織結(jié)構(gòu)精細(xì)且復(fù)雜度極高，常規(guī)熒光染色極易出現(xiàn)信號(hào)丟失、染色不均等問題。而基于TSA的自動(dòng)化染色體系，無論是胚胎四標(biāo)臟器分布檢測(cè)、三標(biāo)細(xì)胞增殖檢測(cè)還是雙標(biāo)代謝活性檢測(cè)，都能輸出高信噪比、高清晰度的熒光圖像，能夠精準(zhǔn)識(shí)別胚胎細(xì)微組織結(jié)構(gòu)中的靶標(biāo)分子。同時(shí)該技術(shù)可兼容石蠟切片、冰凍切片、培養(yǎng)細(xì)胞多種樣本，適配臨床病理樣本與基礎(chǔ)科研樣本，對(duì)比傳統(tǒng)染色方法嚴(yán)苛的樣本要求，TSA技術(shù)擁有更廣的實(shí)驗(yàn)適用場(chǎng)景，適配全類型組織原位分子檢測(cè)需求。
八、TSA技術(shù)核心優(yōu)勢(shì)匯總
綜合全文實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與六組成像結(jié)果可知，酪胺信號(hào)放大技術(shù)（TSA）有效攻克了傳統(tǒng)免疫熒光染色的多項(xiàng)技術(shù)難題，是組織原位多分子檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)。結(jié)合本次文獻(xiàn)研究，可歸納出TSA五大不可替代的核心優(yōu)勢(shì)：
? 檢測(cè)靈敏度高：能夠有效放大低豐度靶蛋白的微弱熒光信號(hào)，解決了傳統(tǒng)方法對(duì)低表達(dá)靶點(diǎn)易漏檢的問題。
? 信號(hào)靶向性優(yōu)異：僅針對(duì)抗原 - 抗體特異性結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)放大，不會(huì)增強(qiáng)組織內(nèi)源背景熒光，保障成像擁有高信噪比。
? 兼容同源一抗：搭配飽和封閉流程，可徹底規(guī)避同種屬抗體的交叉反應(yīng)，大幅拓寬抗體選用范圍。
? 支持高通量多標(biāo)檢測(cè)：打破傳統(tǒng)免疫熒光最多三標(biāo)的限制，可完成四標(biāo)及以上多靶點(diǎn)同步染色，充分挖掘單張組織切片的實(shí)驗(yàn)價(jià)值。
? 通用性與穩(wěn)定性佳：可無縫對(duì)接全自動(dòng)染色設(shè)備，提升實(shí)驗(yàn)重復(fù)性；同時(shí)兼容石蠟切片、冰凍切片、胚胎組織、臨床病理樣本等多種實(shí)驗(yàn)材料。
相較于免疫組化體系，應(yīng)用于免疫熒光的 TSA 技術(shù)還能維持熒光信號(hào)強(qiáng)度與靶蛋白表達(dá)量的線性關(guān)聯(lián)，具備精準(zhǔn)定量分析的能力。整體而言，TSA 技術(shù)在靈敏度、抗體兼容性、檢測(cè)通量、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性與定量能力上均展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，已成為組織多重免疫熒光檢測(cè)中不可或缺的核心技術(shù)。
參考文獻(xiàn)
Yarilin D, Xu K, Turkekul M, Fan N, Romin Y, Fijisawa S, Barlas A, Manova-Todorova K. Machine-based method for multiplex in situ molecular characterization of tissues by immunofluorescence detection. Sci Rep. 2015 Mar 31; 5:9534. doi: 10.1038/srep09534. PMID: 25826597; PMCID: PMC4821037.
如果您正在開展腫瘤免疫微環(huán)境、空間生物學(xué)或多Marker共定位研究，歡迎咨詢 EnkiLife TSA多重?zé)晒饷庖呓M化技術(shù)服務(wù)，我們可提供從Panel設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到數(shù)據(jù)分析的一站式解決方案。
