摘要：本文詳解iZON基于TFF切向流過濾+Zenco自動(dòng)化層析系統(tǒng)的大規(guī)模外泌體純化解決方案，覆蓋從中試放大到GMP生產(chǎn)的全流程工藝路徑。

關(guān)鍵詞：外泌體、外泌體純化、iZON、qEV外泌體純化柱、qEV、TFF切向流過濾、Zenco自動(dòng)化層析系統(tǒng)、iZON Science、大規(guī)模外泌體純化、外泌體規(guī)模化生產(chǎn)

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在外泌體（EV）類藥物的研發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)純化工藝存在明顯局限性：針對(duì)數(shù)十升級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)上清，常規(guī)尺寸排阻色譜（SEC）單柱分離模式處理通量不足；超速離心（UC）用于大體積樣本制備時(shí)，存在處理周期長、產(chǎn)物回收率重復(fù)性差等問題；粗提外泌體樣品中蛋白雜質(zhì)富集，大幅提升下游精制難度。

究其根源是，現(xiàn)有主流外泌體純化技術(shù)均以實(shí)驗(yàn)室毫升級(jí)小樣本處理為應(yīng)用場景，在向中試、工業(yè)化（升級(jí)至升級(jí)、百升級(jí)）放大過程中，難以平衡處理通量、運(yùn)行效率與產(chǎn)品純度三大核心指標(biāo)。

曼博生物技術(shù)團(tuán)隊(duì)結(jié)合行業(yè)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，對(duì)iZON Science規(guī)?；饷隗w純化體系進(jìn)行系統(tǒng)性梳理。該方案整合TFF切向流過濾技術(shù)與Zenco自動(dòng)化層析，可為外泌體產(chǎn)業(yè)化提供從工藝開發(fā)到規(guī)?；a(chǎn)品放行的全流程標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)路線。

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一、從小量到大規(guī)模：外泌體純化的“規(guī)模鴻溝”

外泌體研究從基礎(chǔ)科研走向臨床轉(zhuǎn)化的過程中，一個(gè)容易被低估但具挑戰(zhàn)性的環(huán)節(jié)，就是純化規(guī)模的放大。

以一間典型的細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)室為例：使用2D培養(yǎng)瓶收集的上清液通常僅10-500mL，用一根qEV original或qEV10即可完成純化，15分鐘去除≥99%游離蛋白，操作輕松簡單。

但當(dāng)你的工藝推進(jìn)到以下階段時(shí)，情況會(huì)發(fā)生根本性變化——

表1.外泌體純化不同生產(chǎn)階段面臨的核心問題

外泌體產(chǎn)業(yè)化的瓶頸，往往不是"養(yǎng)不出細(xì)胞"，而是"提不出產(chǎn)物"。當(dāng)上游培養(yǎng)體系已經(jīng)能做到百升級(jí)時(shí)，下游純化如果還停留在手工操作，整個(gè)工藝就會(huì)被"卡脖子"。

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二、核心起點(diǎn)：qEV系列——大規(guī)模純化的"基本盤"

無論是小量還是大規(guī)模，SEC尺寸排阻色譜始終是iZON純化體系的基石。iZON qEV系列（點(diǎn)擊查看）采用高性能瓊脂糖樹脂作為固定相，利用分子篩效應(yīng)實(shí)現(xiàn)外泌體與游離蛋白的分離——大顆粒（外泌體）走"快車道"優(yōu)先洗脫，小分子蛋白進(jìn)入樹脂孔道滯后排出。

核心技術(shù)參數(shù)：

? 分離時(shí)間：≤15分鐘

? 蛋白去除率：≥99%

? 囊泡完整性：溫和無損，保持生物活性

? 認(rèn)證：ISO13485:2016（醫(yī)療器械）

? 樣本多樣性：適配培養(yǎng)基上清、血漿、復(fù)雜生物樣本來源

在大規(guī)模純化場景下，qEV的可放大能力體現(xiàn)在規(guī)格自選、多孔徑選擇、GMP-Ready三個(gè)方面。

規(guī)格自選：從150μL到100mL

表2.IZON ScienceqEV柱系列產(chǎn)品型號(hào)

圖1.qEV柱系列產(chǎn)品

20nm/35nm/70nm多孔徑選擇：

20nm回收范圍20-150nm，適配小型外泌體收集；

35nm回收范圍35-350nm，對(duì)<110nm的小EV回收率更高；

70nm回收范圍70-1000nm，脂蛋白交叉污染更少。

GMP-Ready：合規(guī)從"起步"開始。針對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和治療性應(yīng)用，iZON提供qEV GMP-Ready純化柱——在受控環(huán)境中按需生產(chǎn)，每批次經(jīng)過生物負(fù)載與內(nèi)毒素檢測，附分析證書（CoA）及法規(guī)支持文件（RSF）。核心優(yōu)勢在于：方法開發(fā)階段使用qEV建立的SEC工藝參數(shù)，可直接平移至GMP生產(chǎn)，無需因合規(guī)升級(jí)而更換分離介質(zhì)或重新驗(yàn)證工藝。

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三、qEV TFF——大體積樣本的濃縮預(yù)處理

當(dāng)樣本體積超過1L時(shí)，雖可選用qEV100色譜柱進(jìn)行逐管處理，但此方式操作繁瑣、總運(yùn)行時(shí)間明顯。更為關(guān)鍵的是，大規(guī)模樣本中的細(xì)胞外囊泡（EVs）濃度通常受到大量培養(yǎng)液或生物體液的稀釋，直接采用尺寸排阻色譜（SEC）進(jìn)行分離，純化效率不理想。

針對(duì)以上痛點(diǎn)，切向流過濃縮（Tangential Flow Filtration,TFF）成為大體積EV樣本前處理的理想技術(shù)選擇。其獨(dú)特的流體運(yùn)行方式是技術(shù)核心：樣本料液并非垂直沖擊濾膜，而是沿著濾膜表面平行流動(dòng)；在跨膜壓力作用下，培養(yǎng)液中的水分、小分子雜質(zhì)、游離蛋白等物質(zhì)順利透過濾膜，形成滲透液被分離出去；細(xì)胞外囊泡這類目標(biāo)顆粒因粒徑大于濾膜孔徑。被截留在循環(huán)管路內(nèi)不斷富集。依靠連續(xù)循環(huán)的工作模式，TFF能夠更快更好完成大體積樣本的濃縮，同時(shí)截留去除部分可溶性雜質(zhì)，在實(shí)現(xiàn)EV富集的同時(shí)完成初步純化，更好銜接后續(xù)SEC精制工藝。

圖2.TFF切向流濃縮設(shè)備圖

TFF相較于傳統(tǒng)超速離心的核心優(yōu)勢：

表3.TFF相較于傳統(tǒng)超速離心的核心優(yōu)勢

iZON的qEVTFF系統(tǒng)將TFF與SEC整合為一套完整方案：

步驟一：TFF濃縮與緩沖液置換→將數(shù)升至數(shù)十升的樣本濃縮至qEV柱的上樣體積范圍內(nèi)，同時(shí)完成緩沖液置換（去除小分子雜質(zhì)）。

步驟二：qEVSEC精細(xì)純化→濃縮液上樣至qEV純化柱，利用SEC的分子篩效應(yīng)實(shí)現(xiàn)高蛋白去除。

兩步雙重保障下的效果：蛋白去除率>99%，外泌體結(jié)構(gòu)完整、生物活性保留，回收率高、工藝可重復(fù)。

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四、qEV Zenco——讓純化實(shí)現(xiàn)"全自動(dòng)、可追溯"

當(dāng)樣本量進(jìn)一步上升至中試和臨床生產(chǎn)階段（10-400L），僅僅依靠TFF+qEV手動(dòng)操作仍然不夠——自動(dòng)化、封閉系統(tǒng)和數(shù)據(jù)完整性成為新的硬性要求。

qEV Zenco自動(dòng)化層析系統(tǒng)（點(diǎn)擊查看）正是為這一場景設(shè)計(jì)的解決方案。

圖3.qEVZenco設(shè)備介紹圖

Zenco的核心技術(shù)參數(shù)：

表4.Zenco的核心技術(shù)參數(shù)

Zenco解決的核心痛點(diǎn)：

① 從"手工"到"全自動(dòng)"。傳統(tǒng)的手動(dòng)SEC純化需要操作者全程值守——加樣、收集、標(biāo)記、記錄，不僅耗時(shí)，而且容易出錯(cuò)。Zenco通過預(yù)編程方法自動(dòng)完成上樣、洗脫、收集全流程，操作者只需裝載樣本和啟動(dòng)程序。

② 從"盲跑"到"實(shí)時(shí)監(jiān)控"。SEC分離過程中，EV洗脫窗口的定位是決定純度的關(guān)鍵。Zenco集成的UV/pH/電導(dǎo)率三維在線傳感可實(shí)時(shí)監(jiān)測洗脫曲線，自動(dòng)識(shí)別外泌體富集峰位，確保每次收集都在"正確的時(shí)間窗口"截取正確的餾分。

③ 從"手動(dòng)記錄"到"合規(guī)可溯源"。對(duì)于GMP生產(chǎn)，數(shù)據(jù)完整性是不可妥協(xié)的要求。Zenco的系統(tǒng)軟件符合FDA21 CFR Part11標(biāo)準(zhǔn)，自動(dòng)生成包含所有工藝參數(shù)的批次報(bào)告，可直接用于監(jiān)管申報(bào)。

④ 從"小試"到"GMP"的同一體系。與qEV的GMP-Ready產(chǎn)品類似，Zenco也提供Big Zenco GMP版本——從實(shí)驗(yàn)室小試到大生產(chǎn)的工藝參數(shù)可以在同一體系上直接平移，無需重新開發(fā)方法或更換設(shè)備。

⑤ 全系列柱型兼容+RFID智能識(shí)別管理。Zenco系統(tǒng)可全面適配qEV2、qEV10、qEV100及工業(yè)定制款全系列SEC色譜柱，覆蓋從微量樣本到百毫升級(jí)大體積樣本的分離需求，一套設(shè)備即可匹配不同實(shí)驗(yàn)規(guī)模。同時(shí)，Zenco搭載專用RFID識(shí)別模塊，可自動(dòng)讀取qEV柱內(nèi)置電子標(biāo)簽，快速識(shí)別色譜柱型號(hào)、規(guī)格、批次、使用次數(shù)等核心信息，無需人工手動(dòng)錄入柱參數(shù)。該功能不僅能規(guī)避人為選錯(cuò)柱型、參數(shù)匹配錯(cuò)誤等問題，還可全程記錄色譜柱使用履歷、運(yùn)行壓力、適配工藝等數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)色譜柱全生命周期智能化管控，進(jìn)一步提升實(shí)驗(yàn)規(guī)范性與數(shù)據(jù)完整性。

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五、從TFF到Zenco：完整的大規(guī)模純化路線圖

表5.不同樣本體積的純化推薦方案

TFF解決的是"體積太大裝不下"的問題——濃縮先行。Zenco解決的是"通量太大手跟不上"的問題——自動(dòng)化兜底。

圖4.規(guī)模化放大示例

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六、FAQ快問快答

Q1：TFF+SEC聯(lián)用和單獨(dú)使用SEC相比，純度有差別嗎？

A：TFF作為前置濃縮與粗濾步驟，可以去除大部分小分子雜質(zhì)和部分蛋白，再經(jīng)SEC精細(xì)純化后，蛋白去除率可穩(wěn)定維持在>99%。更關(guān)鍵的是，TFF使大體積樣本的處理變得可行，這是單獨(dú)SEC無法做到的。

Q2：Zenco可以使用現(xiàn)有的qEV柱子嗎？

A：可以。Zenco兼容qEV2、qEV10、qEV100及工業(yè)級(jí)定制色譜柱，現(xiàn)有工藝無需更換柱型即可接入自動(dòng)化設(shè)備。

Q3：TFF會(huì)破壞外泌體嗎？

A：不會(huì)。TFF屬于低剪切力過濾技術(shù)，與超速離心的高剪切力破壞機(jī)制不同，TFF在濃縮過程中可完整保留外泌體的結(jié)構(gòu)與生物活性。

Q4：Zenco的軟件是否滿足數(shù)據(jù)完整性要求？

A：滿足。Zenco系統(tǒng)軟件符合FDA 21 CFR Part11要求，具備用戶權(quán)限管理、審計(jì)追蹤、電子簽名等功能，可自動(dòng)生成完整的可追溯工藝報(bào)告。

Q5：從實(shí)驗(yàn)室小試到GMP生產(chǎn)，工藝需要重新開發(fā)嗎？

A：不需要。qEV GMP-Ready純化柱+Zenco/Big Zenco GMP的組合，確保從小試到商業(yè)化生產(chǎn)的全鏈條工藝可直接平移。

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本文基于公開資料由iZON Science中國正規(guī)合作伙伴上海曼博生物整理，用于科研信息分享、實(shí)驗(yàn)參考。上海曼博生物可提供iZON Science qEV系列外泌體純化柱（qEVsingle/original/1/2/10/100）、qEV TFF切向流過濾系統(tǒng)、qEV Zenco自動(dòng)化層析系統(tǒng)、Big Zenco GMP、AFC V2、qEV DXter、Exoid TRPS單顆粒分析儀及Pulsoid NPS納米顆粒分析儀等全系列產(chǎn)品，支持細(xì)胞外囊泡（EV）分離純化、外泌體表征分析、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）質(zhì)控、病毒載體檢測及納米醫(yī)藥研究等科研與臨床前應(yīng)用。歡迎咨詢曼博生物！