在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，PD-1/PD-L1 抑制劑與 CAR-T 療法雖已取得突破性進(jìn)展，但耐藥性和低響應(yīng)率仍是制約臨床療效的關(guān)鍵瓶頸。近期發(fā)表于《Molecular Therapy》的一項(xiàng)重磅研究，首次揭示了 TRIM21 通過(guò) K63 連接泛素化穩(wěn)定 PD-1 的全新調(diào)控機(jī)制，為免疫治療增效提供了創(chuàng)新性靶點(diǎn)。值得關(guān)注的是，愛(ài)必信（Absin）的 Brefeldin A（產(chǎn)品貨號(hào)：abs810012）作為實(shí)驗(yàn)核心工具試劑，在胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)中發(fā)揮了不可或缺的作用，為研究結(jié)論的驗(yàn)證提供了可靠支撐。

文獻(xiàn)標(biāo)題：Targeting the TRIM21-PD-1 axis potentiates immune checkpoint blockade and CAR-T cell therapy
發(fā)表期刊：Mol Ther. (IF=12)
DOI：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.01.047
使用 Absin 產(chǎn)品：Brefeldin A（貨號(hào)：abs810012）

一、研究思路：聚焦免疫細(xì)胞中 TRIM21 的"隱藏功能"

此前研究多聚焦 TRIM21 在腫瘤細(xì)胞中的作用，但其在免疫細(xì)胞中的功能尚未明確。鑒于 TRIM21 在淋巴器官高表達(dá)，且 PD-1 是 T 細(xì)胞功能抑制的核心分子，研究團(tuán)隊(duì)提出核心科學(xué)問(wèn)題：TRIM21 是否通過(guò)調(diào)控 PD-1 影響 CD8?T 細(xì)胞的抗腫瘤活性？

為解答這一問(wèn)題，研究設(shè)計(jì)了層層遞進(jìn)的驗(yàn)證路徑：

1. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建 TRIM21 敲除（KO）小鼠，接種 LLC 肺癌細(xì)胞和 MC38 結(jié)直腸癌細(xì)胞，觀察腫瘤生長(zhǎng)及 CD8?T 細(xì)胞功能變化；

2. 體外機(jī)制：探究 TRIM21 對(duì) PD-1 表達(dá)的調(diào)控方式（轉(zhuǎn)錄/翻譯后水平），驗(yàn)證二者相互作用及泛素化修飾類(lèi)型；

3. 治療潛力：在動(dòng)物模型中驗(yàn)證 TRIM21 缺失對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（抗 CTLA-4）和 CAR-T 療法的增效作用。

二、核心研究成果：TRIM21-PD-1 軸成免疫治療新突破口

1. TRIM21 缺失顯著增強(qiáng) CD8?T 細(xì)胞抗腫瘤能力

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，TRIM21 KO 小鼠接種腫瘤細(xì)胞后，腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑（原文圖 1A、1B、1H、1I）。流式分析證實(shí)，KO 小鼠腫瘤微環(huán)境中 CD8?T 細(xì)胞比例顯著升高，且分泌 IFN-γ、TNF、GzmB 等效應(yīng)細(xì)胞因子的能力大幅增強(qiáng)（原文圖 1E、1L）。進(jìn)一步的 CD8?T 細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)表明，這種抗腫瘤效應(yīng)完全依賴 CD8?T 細(xì)胞（原文圖 1N-S），明確了 TRIM21 對(duì) CD8?T 細(xì)胞功能的抑制作用。

Figure 1.

Trim21 KO mice display improved CD8+ T cell anti-tumor immune response
（A and B）WT 或 Trim21 KO C57BL/6N 小鼠皮下 LLC 腫瘤的生長(zhǎng)曲線（A）和終點(diǎn)腫瘤重量（B）。n = 5 mice per group.（C）流式細(xì)胞術(shù)分析顯示 LLC 腫瘤中浸潤(rùn)的 CD8+ 和 CD4+ T 細(xì)胞占 CD3+ T 細(xì)胞的百分比。（D）Foxp3+ Treg 細(xì)胞占 CD4+ T 細(xì)胞的百分比。（E）LLC 腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ+、TNF+ 和 GzmB+ 細(xì)胞因子的百分比。n = 5 mice per group.（F and G）WT（n = 5）和 Trim21 KO（n = 7）小鼠尾靜脈注射 LLC 細(xì)胞后肺組織的 H&E 染色代表性圖像（F）、腫瘤面積、腫瘤大小或腫瘤數(shù)量（G）。Scale bars, 2 mm.（H and I）WT 或 Trim21 KO 小鼠 MC38 腫瘤的生長(zhǎng)曲線（H）和終點(diǎn)腫瘤重量（I）。n = 6 mice per group.（J）MC38 腫瘤中浸潤(rùn)的 CD8+ 和 CD4+ T 細(xì)胞分析。（K）MC38 腫瘤中 Foxp3+ Treg 細(xì)胞分析。（L）MC38 腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的分析。n = 6 mice per group.（M）治療策略示意圖。（N and O）WT 或 Trim21 KO 小鼠 LLC 腫瘤接受對(duì)照 IgG 或抗 CD8α 治療的生長(zhǎng)曲線（N）和終點(diǎn)腫瘤重量（O）。n = 6 mice per group.（P）各處理組 LLC 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞的流式分析。n = 6 mice per group.（Q and R）MC38 腫瘤生長(zhǎng)曲線（Q）和終點(diǎn)重量（R）。n = 6 mice per group.（S）各處理組 MC38 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞的流式分析。n = 6 mice per group.

2. TRIM21 通過(guò) K63 連接泛素化穩(wěn)定 PD-1 蛋白

機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，TRIM21 并不影響 PD-1 的 mRNA 水平，而是通過(guò)翻譯后修飾調(diào)控其穩(wěn)定性。TRIM21 與 PD-1 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，在 K233 位點(diǎn)催化 PD-1 發(fā)生 K63 連接泛素化，從而拮抗其 K48 連接泛素化介導(dǎo)的降解（原文圖 3）。敲除 TRIM21 后，PD-1 蛋白半衰期縮短，CD8?T 細(xì)胞活化標(biāo)志物 CD69 表達(dá)上調(diào)，增殖能力顯著增強(qiáng)（原文圖 2U、2S）。

Figure 2.

TRIM21 deficiency destabilizes PD-1 and promotes the activation of CD8+ T cells in vitro
（A）WT 或 Trim21 KO 小鼠 CD8+ T 細(xì)胞全細(xì)胞裂解液的 IB 分析。CD8+ T 細(xì)胞用 α-CD3/CD28（2 μg/mL）刺激 48 h。（B–I）WT 或 Trim21 KO 小鼠脾臟 CD8+ T 細(xì)胞 PD-1（B）、PD-L1（C）、CTLA-4（D）、TIM-3（E）、VISTA（F）、LAG3（G）、TIGIT（H）和 CD47（I）的平均熒光強(qiáng)度（MFI）定量。n = 4 mice per group.（J and K）LLC 腫瘤（n = 5）或 MC38 腫瘤（n = 6）中浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞 PD-1 的 MFI。（L–O）Jurkat 或 MOLT-4 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) shTRIM21 或 shGFP 的全細(xì)胞裂解液 IB 分析（L, M）。MOLT-4 細(xì)胞表面 PD-1 的流式分析（N）和相對(duì) MFI 定量（O）。n = 3 biologically independent samples.（P）HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PD-1-cHA 和 Flag 標(biāo)記的 TRIM21 WT 或其酶活性突變體 C16A 后的 IB 分析。（Q and R）MOLT-4 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) shTRIM21 或 shGFP 的全細(xì)胞裂解液 IB 分析（Q）。用 200 μg/mL 放線菌酮（CHX）處理不同時(shí)間點(diǎn)后的 PD-1 條帶強(qiáng)度定量（R）。（S）脾臟 WT 或 Trim21 KO CD8+ T 細(xì)胞的 Ki67 表達(dá)。n = 4 per group.（T）脾臟 CD8+ T 細(xì)胞的凋亡分析。n = 4 mice per group.（U）脾臟 WT 或 Trim21 KO CD8+ T 細(xì)胞的 CD69 表達(dá)。n = 4 per group.（V）脾臟 CD8+ T 細(xì)胞 IFN-γ+、TNF+ 和 GzmB+ 的分析。n = 4 mice per group.

Figure 3.

TRIM21 interacts with PD-1 and promotes its K63-linked ubiquitination
（A）Jurkat 細(xì)胞全細(xì)胞裂解液（WCLs）和抗 TRIM21 免疫沉淀物（IPs）的 IB 分析。IgG 用作陰性對(duì)照。（B and E）TRIM21（B）和 PD-1（E）蛋白序列示意圖。（C）HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PD-1-cFlag 和 HA-TRIM21 WT 或截短突變體后的 WCLs 和抗 Flag IPs 的 IB 分析。（D）GST 和 GST 標(biāo)記的 TRIM21 突變體與 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PD-1-cHA 后的 WCLs 孵育的 GST pull-down 沉淀物 IB 分析。（F）His-TRIM21 與 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PD-1-cHA 或截短突變體后的 WCLs 孵育的 His pull-down 產(chǎn)物 IB 分析。（G）GST 和 GST 標(biāo)記的 PD-1（氨基酸 192–288）與 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HA-TRIM21 后的 WCLs 孵育的 GST pull-down 沉淀物 IB 分析。（H）在鹽酸胍變性緩沖液中的 His-tag pull-down 實(shí)驗(yàn)顯示 TRIM21 WT 而非 C16A 突變體促進(jìn) PD-1 的泛素化。（I and J）His-tag pull-down 實(shí)驗(yàn)顯示 TRIM21 促進(jìn) K63 連接的泛素化而非 K48 連接的泛素化。（K）在 MOLT-4 細(xì)胞中檢測(cè)到內(nèi)源性 PD-1 的 K63 連接泛素化。（L）K233 而非 K210 是 TRIM21 介導(dǎo)的泛素化或 K63 連接泛素化的主要修飾位點(diǎn)。

3. 靶向 TRIM21 顯著提升免疫治療效果

• 免疫檢查點(diǎn)抑制劑增效：TRIM21 KO 小鼠接受抗 CTLA-4 治療后，腫瘤控制效果遠(yuǎn)超野生型小鼠，CD8?T 細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞因子分泌進(jìn)一步增強(qiáng)（原文圖 4）；

• CAR-T 療法優(yōu)化：TRIM21 KO 的抗 CD19 CAR-T 細(xì)胞在 LLC-hCD19 和 MC38-hCD19 腫瘤模型中，表現(xiàn)出更低的 PD-1 表達(dá)和更強(qiáng)的腫瘤殺傷活性（原文圖 5）。

這些結(jié)果表明，靶向 TRIM21 可通過(guò)降低 PD-1 表達(dá)、增強(qiáng) CD8?T 細(xì)胞功能，為免疫治療聯(lián)合策略提供了新方向。

Figure 4.

TRIM21 KO sensitizes tumors to anti-CTLA-4 immunotherapy
（A）小鼠 LLC 腫瘤模型中抗 CTLA-4 治療策略示意圖。（B–D）WT 或 Trim21 KO 小鼠皮下 LLC 腫瘤的生長(zhǎng)曲線（B）、終點(diǎn)腫瘤圖像（C）和終點(diǎn)腫瘤重量（D）。n = 6 mice per group.（E）各處理組 LLC 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞 PD-1 的 MFI。n = 6 mice per group.（F）各處理組 LLC 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ 占 CD3+ T 細(xì)胞的百分比。n = 6 mice per group.（G–I）各處理組 LLC 腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞的 IFN-γ+（G）、TNF+（H）和 GzmB+（I）百分比。n = 6 mice per group.（J）WT 或 Trim21 KO 小鼠 MC38 腫瘤的生長(zhǎng)曲線。n = 6 mice per group.（K）各處理組 MC38 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞 PD-1 的 MFI。n = 6 mice per group.（L）各處理組 MC38 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ 占 CD3+ T 細(xì)胞的百分比。n = 6 mice per group.（M–O）各處理組 MC38 腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞的 IFN-γ+（M）、TNF+（N）和 GzmB+（O）百分比。n = 6 mice per group.

Figure 5.

TRIM21 deficiency improves antitumor efficacy of CAR-T cells
（A and B）免疫健全小鼠接受 WT 和 Trim21 KO 抗 CD19 CAR-T 細(xì)胞以及 T 細(xì)胞（對(duì)照）過(guò)繼轉(zhuǎn)移后皮下 LLC-hCD19 腫瘤的生長(zhǎng)曲線（A）和終點(diǎn)腫瘤重量（B）。n = 5 mice per group.（C）各處理組 LLC-hCD19 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ CAR-T 細(xì)胞 PD-1 的 MFI。n = 5 mice per group.（D–F）各處理組 LLC-hCD19 腫瘤中 CD8+ CAR-T 細(xì)胞的 IFN-γ+（D）、TNF+（E）和 GzmB+（F）百分比。n = 5 mice per group.（G and H）免疫健全小鼠接受 WT 和 Trim21 KO 抗 CD19 CAR-T 細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移后皮下 MC38-hCD19 腫瘤的生長(zhǎng)曲線（G）和終點(diǎn)腫瘤重量（H）。n = 5 mice per group.（I）各處理組 MC38-hCD19 腫瘤中浸潤(rùn) CD8+ CAR-T 細(xì)胞 PD-1 的 MFI。n = 5 mice per group.（J–L）各處理組 MC38-hCD19 腫瘤中 CD8+ CAR-T 細(xì)胞的 IFN-γ+（J）、TNF+（K）和 GzmB+（L）百分比。n = 5 mice per group.

三、abs810012 的關(guān)鍵作用：胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"工具

在解析 CD8?T 細(xì)胞功能的核心實(shí)驗(yàn)中，準(zhǔn)確量化胞內(nèi) IFN-γ、TNF、GzmB 等細(xì)胞因子的表達(dá)水平是驗(yàn)證結(jié)論的關(guān)鍵。而愛(ài)必信的 Brefeldin A（abs810012）正是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的核心試劑。

產(chǎn)品作用原理

Brefeldin A 是經(jīng)典的高爾基體抑制劑，能夠特異性阻斷蛋白質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)中，研究人員用抗 CD3/CD28 抗體刺激 CD8?T 細(xì)胞后，加入 abs810012 處理 5 小時(shí)（原文"Mouse primary T cell isolation and stimulation"部分），可有效抑制細(xì)胞因子向胞外分泌，使其在胞內(nèi)積累，從而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)精準(zhǔn)檢測(cè)到細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平。

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用與數(shù)據(jù)支撐

abs810012 的使用直接支撐了兩項(xiàng)核心結(jié)論的驗(yàn)證：

1. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：證實(shí) TRIM21 KO 小鼠腫瘤浸潤(rùn) CD8?T 細(xì)胞的 IFN-γ、TNF、GzmB 分泌能力顯著增強(qiáng)（原文圖 1E、1L）；

2. 體外實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證 TRIM21 KO CD8?T 細(xì)胞活化后，胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著升高（原文圖 2V）。

正是憑借 abs810012 可靠的高爾基體抑制效果，研究團(tuán)隊(duì)得以精準(zhǔn)量化 CD8?T 細(xì)胞的功能狀態(tài)，為 TRIM21 調(diào)控 T 細(xì)胞活性的核心結(jié)論提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

四、產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)與實(shí)驗(yàn)價(jià)值

愛(ài)必信的 Brefeldin A（abs810012）具有高純度、高特異性的產(chǎn)品特性，能夠高效阻斷胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，確保胞內(nèi)細(xì)胞因子的充分積累。在本研究中，該產(chǎn)品成功支持了流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的精準(zhǔn)檢測(cè)，其穩(wěn)定的性能的確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和可重復(fù)性，成為連接機(jī)制探究與功能驗(yàn)證的關(guān)鍵工具。

五、總結(jié)與展望

本研究首次闡明了 TRIM21 通過(guò) K63 連接泛素化穩(wěn)定 PD-1 的分子機(jī)制，證實(shí)靶向 TRIM21 可增強(qiáng) CD8?T 細(xì)胞的抗腫瘤活性，為免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療及 CAR-T 細(xì)胞療法優(yōu)化提供了新策略。愛(ài)必信 abs810012 作為實(shí)驗(yàn)核心工具，在胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)中展現(xiàn)了優(yōu)異的性能，助力研究團(tuán)隊(duì)高效完成了功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，充分體現(xiàn)了高品質(zhì)試劑對(duì)生命科學(xué)研究的重要支撐作用。

未來(lái)，針對(duì) TRIM21 的抑制劑開(kāi)發(fā)或 TRIM21 敲除的 CAR-T 細(xì)胞療法，有望成為攻克腫瘤免疫治療耐藥的新方向。愛(ài)必信也將持續(xù)深耕生命科學(xué)工具試劑領(lǐng)域，為更多創(chuàng)新性研究提供穩(wěn)定、可靠的產(chǎn)品支持，助力科研工作者解鎖更多生命科學(xué)奧秘。

如果您正在開(kāi)展 T 細(xì)胞功能、免疫治療機(jī)制等相關(guān)研究，abs810012 將是胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)的理想選擇，歡迎隨時(shí)咨詢產(chǎn)品詳情或技術(shù)支持！