重組蛋白制備是分子生物學(xué)領(lǐng)域的成熟技術(shù)，但實(shí)際操作中容易受多環(huán)節(jié)因素影響，?常見問題主要集中在表達(dá)體系選擇、基因設(shè)計、表達(dá)純化過程三個方面?，具體如下：
一、表達(dá)體系與宿主選擇不當(dāng)導(dǎo)致的問題
1、翻譯后修飾缺失?
原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）無法完成糖基化、磷酸化等真核蛋白所需的翻譯后修飾，會直接導(dǎo)致蛋白活性缺失或折疊異常。
2、宿主毒性與代謝負(fù)荷過載?
強(qiáng)啟動子搭配高拷貝質(zhì)粒，導(dǎo)致外源蛋白過量表達(dá)，對宿主細(xì)胞造成嚴(yán)重代謝負(fù)擔(dān)，引發(fā)宿主生長緩慢、表達(dá)異質(zhì)性，最終導(dǎo)致折疊錯誤。
3、折疊環(huán)境不匹配?
復(fù)雜結(jié)構(gòu)蛋白（如含二硫鍵、疏水跨膜區(qū)段的蛋白）在大腸桿菌還原性細(xì)胞質(zhì)中，難以形成正確二硫鍵，易出現(xiàn)聚集、低得率問題。
二、基因設(shè)計與序列層面的常見問題
1、稀有密碼子影響翻譯?
外源基因含有宿主使用頻率極低的密碼子，會導(dǎo)致翻譯中斷、錯義突變，尤其高表達(dá)量下問題更突出。
2、mRNA結(jié)構(gòu)異常降低表達(dá)效率?
翻譯起始區(qū)GC含量過高，或mRNA形成過度折疊的二級結(jié)構(gòu)，會阻礙翻譯起始復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致表達(dá)效率下降甚至產(chǎn)生截斷蛋白。
3、疏水區(qū)域引發(fā)聚集降解?
保留不必要的信號肽、跨膜區(qū)或大量低復(fù)雜度疏水區(qū)段，會導(dǎo)致蛋白插膜、聚集，增加降解風(fēng)險。
4、標(biāo)簽選擇不合理?
純化標(biāo)簽或促溶標(biāo)簽選擇不當(dāng)，可能對后續(xù)蛋白活性研究產(chǎn)生干擾，或無法起到促溶作用。
三、表達(dá)及純化過程中的典型問題
1.蛋白完全不表達(dá)
蛋白分子量極端：原核表達(dá)中小于10kD或大于100kD的蛋白本身表達(dá)難度較高；
質(zhì)粒構(gòu)建錯誤：質(zhì)粒構(gòu)建后未測序驗(yàn)證，存在移碼、突變問題；
菌株與載體不配套：如T7啟動子的載體未使用BL21系列配套菌株；
表達(dá)條件不合適：誘導(dǎo)方式錯誤、培養(yǎng)基營養(yǎng)不足，可換用富營養(yǎng)TB培養(yǎng)基嘗試。
2.包涵體形成（蛋白錯誤折疊聚集）
這是原核表達(dá)最常見的問題，主要因表達(dá)過快來不及折疊、缺少翻譯后修飾、蛋白本身疏水性強(qiáng)導(dǎo)致。會造成蛋白無活性，后續(xù)復(fù)性難度高。
3.蛋白降解
細(xì)菌本身的蛋白酶導(dǎo)致降解，破胞和操作中未保持低溫、未添加蛋白酶抑制劑；
蛋白N端序列不符合穩(wěn)定性規(guī)律，如甲硫氨酸后接精氨酸、賴氨酸等氨基酸，會顯著降低蛋白穩(wěn)定性；
密碼子偏好性不匹配，導(dǎo)致表達(dá)提前終止。
4.蛋白純度不達(dá)標(biāo)
Ni柱親和純化時雜蛋白去除不徹底，分子伴侶容易與目的蛋白共洗脫難以分離；
僅單一親和層析方式純化，未結(jié)合離子交換、分子篩等其他純化手段聯(lián)用。
5.折疊錯誤與活性不足
即使蛋白可溶表達(dá)，也可能因折疊錯誤、翻譯后修飾不正確，導(dǎo)致蛋白無生物活性，尤其是對結(jié)構(gòu)、修飾要求高的真核蛋白，該問題更突出。
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