過去十年，如果說哪項(xiàng)技術(shù)最讓腫瘤領(lǐng)域興奮，CAR-T一定排得上前幾位。它讓部分白血病和淋巴瘤患者獲得了長(zhǎng)期緩解，也讓"活細(xì)胞藥物"真正走進(jìn)了臨床。然而，當(dāng)CAR-T走出血液系統(tǒng)，進(jìn)入實(shí)體瘤之后，故事卻完全變了。

截至目前，全球已經(jīng)開展了數(shù)百項(xiàng)實(shí)體瘤CAR-T臨床研究，從HER2、EGFR到Mesothelin、Claudin18.2，幾乎所有熱門靶點(diǎn)都有人嘗試。但真正能夠復(fù)制CD19 CAR-T成功的案例，卻依然少之又少。

很多人認(rèn)為，這是因?yàn)閷?shí)體瘤微環(huán)境過于復(fù)雜。也有人認(rèn)為，CAR-T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織的能力還不夠強(qiáng)。這些問題確實(shí)存在，但越來越多的研究開始意識(shí)到，真正的第一步，或許就已經(jīng)走錯(cuò)了。

如果一開始選擇的靶點(diǎn)就不夠理想，再先進(jìn)的CAR設(shè)計(jì)，也很難彌補(bǔ)后續(xù)的問題。近期發(fā)表于Nature Cancer的題為GPNMB-directed CAR T cell therapy against MiT/TFE-family fusion-driven solid tumors的一項(xiàng)研究，沒有繼續(xù)優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)，而是把注意力重新放回了最基礎(chǔ)的問題：什么樣的蛋白，才是真正適合CAR-T攻擊的實(shí)體瘤靶點(diǎn)？

過去尋找CAR-T靶點(diǎn)，大多數(shù)研究都會(huì)先比較不同蛋白的表達(dá)量。哪個(gè)表達(dá)最高，就優(yōu)先研究哪個(gè)。

但這篇論文提出了另一種思路。表達(dá)高，并不意味著適合作為CAR-T靶點(diǎn)。真正決定療效的，是這個(gè)蛋白能不能一直存在。如果治療剛開始時(shí)腫瘤細(xì)胞表達(dá)這個(gè)蛋白，而幾周后就因?yàn)榭乖右荻?，那么CAR-T再強(qiáng)，也會(huì)逐漸失去攻擊目標(biāo)。因此，作者把目光投向了一類更特殊的蛋白。它們不是因?yàn)槟[瘤惡性程度高而表達(dá)增加，而是直接受到驅(qū)動(dòng)融合基因調(diào)控。

研究對(duì)象ASPS幾乎都攜帶ASPSCR1-TFE3融合基因，而融合基因持續(xù)激活的下游蛋白中，GPNMB表現(xiàn)出了極其穩(wěn)定的細(xì)胞表面表達(dá)。這意味著，只要融合基因存在，GPNMB就很難"消失"。相比傳統(tǒng)實(shí)體瘤靶點(diǎn)，它更像一個(gè)始終亮著的導(dǎo)航燈。隨后，作者利用患者組織進(jìn)行了驗(yàn)證。無論原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶，無論不同患者之間還是不同病程階段，GPNMB都保持著較高且均一的表達(dá)水平。對(duì)于CAR-T來說，這正是最理想的靶點(diǎn)特征。

GCAR1 在原發(fā)性肺泡狀軟組織肉瘤（ASPS）小鼠模型中的體內(nèi)活性研究

找到靶點(diǎn)之后，作者并沒有急于開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而是一步一步回答了幾個(gè)關(guān)鍵問題。首先，GCAR1是否真的能夠準(zhǔn)確識(shí)別GPNMB？

體外實(shí)驗(yàn)顯示，GCAR1不僅能夠高效殺傷GPNMB陽性腫瘤細(xì)胞，還能夠釋放大量IFN-γ、IL-2等效應(yīng)細(xì)胞因子，說明CAR-T已經(jīng)被充分激活。

來源于患者的 GCAR1 在匹配的臨床前模型中清除 MiT/TFE 家族融合驅(qū)動(dòng)型癌癥

隨后進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。相比對(duì)照組，接受GCAR1治療的小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，多只動(dòng)物獲得持續(xù)腫瘤控制。

這些結(jié)果證明，GPNMB不僅能夠作為CAR-T識(shí)別靶點(diǎn)，而且足以支撐穩(wěn)定的抗腫瘤反應(yīng)。

GCAR1 在人源分層厚度皮膚移植物上的毒性評(píng)估

不過，如果論文到這里結(jié)束，它最多只能算一篇不錯(cuò)的CAR-T研究。真正讓它發(fā)表于Nature Cancer的，是后面的內(nèi)容。

很多論文做到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成功，就已經(jīng)結(jié)束了。但作者繼續(xù)提出了一個(gè)更重要的問題：為什么還有部分病灶沒有消失？

為了回答這個(gè)問題，研究團(tuán)隊(duì)沒有繼續(xù)做傳統(tǒng)流式分析，而是采用了近年來快速發(fā)展的Spatial Transcriptomics，并結(jié)合IHC和IF，對(duì)治療后的腫瘤組織進(jìn)行了空間解析。結(jié)果出乎很多人的預(yù)料。殘留腫瘤依然表達(dá)GPNMB。也就是說，CAR-T失敗并不是因?yàn)檎也坏桨悬c(diǎn)。

真正的問題出現(xiàn)在腫瘤內(nèi)部。

空間轉(zhuǎn)錄組顯示，大量CAR-T細(xì)胞停留在腫瘤邊緣和血管周圍，很難進(jìn)一步進(jìn)入腫瘤核心區(qū)域；與此同時(shí)，PD-L1、TIGIT等免疫抑制分子持續(xù)升高，CAF、巨噬細(xì)胞以及血管相關(guān)細(xì)胞共同構(gòu)建起一道復(fù)雜的免疫屏障，不斷削弱CAR-T的殺傷能力。

一句話總結(jié)就是：CAR-T不是打不過腫瘤，而是根本沒有機(jī)會(huì)真正接近腫瘤。這是整篇論文最重要的發(fā)現(xiàn)。

難治性腫瘤中免疫抑制性生態(tài)位的空間定位分析

既然問題出在免疫微環(huán)境，那么解決思路也就更加明確。作者隨后聯(lián)合PD-L1阻斷治療，并進(jìn)一步優(yōu)化CAR-T細(xì)胞中的PD1和TIGIT信號(hào)。

結(jié)果顯示，無論聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，還是同步優(yōu)化CAR-T本身，都能夠進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤效果。

這也意味著，未來實(shí)體瘤CAR-T的發(fā)展方向，很可能不再只是不斷優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)，而是通過CAR-T、免疫檢查點(diǎn)抑制以及微環(huán)境重塑等多種策略協(xié)同發(fā)揮作用。

更值得關(guān)注的是，作者最后提出了一種新的靶點(diǎn)開發(fā)理念——Fusion-directed Surfaceome。

過去，大家尋找的是"表達(dá)最高"的蛋白；而未來，或許更值得尋找的是那些由驅(qū)動(dòng)基因持續(xù)控制表達(dá)、最不容易發(fā)生抗原逃逸的蛋白。

這不僅適用于ASPS，也可能為更多融合基因驅(qū)動(dòng)的實(shí)體瘤提供新的CAR-T開發(fā)思路。

血液中多克隆 GCAR1 CAR-T 細(xì)胞的擴(kuò)增情況分析

對(duì)于CAR-T研究來說，這項(xiàng)Nature Cancer工作帶來的價(jià)值，不只是增加了一個(gè)新的候選靶點(diǎn)GPNMB，更重要的是，它重新定義了實(shí)體瘤CAR-T靶點(diǎn)篩選的思路：與其尋找表達(dá)最高的蛋白，不如尋找最穩(wěn)定、最難丟失的蛋白。

從靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)到作用機(jī)制解析，研究團(tuán)隊(duì)綜合應(yīng)用了IHC、IF、Flow Cytometry、WB及Spatial Transcriptomics等技術(shù)，對(duì)GPNMB表達(dá)、CAR-T功能及腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行了系統(tǒng)驗(yàn)證。

圍繞CAR-T及腫瘤免疫研究，AntibodySystem提供覆蓋免疫檢查點(diǎn)、CAR-T相關(guān)靶點(diǎn)、腫瘤標(biāo)志物及細(xì)胞因子的科研級(jí)抗體和重組蛋白，可廣泛應(yīng)用于Flow Cytometry、IHC、IF、WB、ELISA等實(shí)驗(yàn)，為CAR-T研發(fā)及腫瘤免疫機(jī)制研究提供可靠的科研工具。