中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研發(fā)主要圍繞腦卒中、睡眠障礙、阿爾茨海默病等疾病，覆蓋神經(jīng)元損傷保護、氧化應激、神經(jīng)炎癥、受體通道、突觸重塑等維度。神經(jīng)藥物研發(fā)存在血腦屏障穿透難、作用靶點復雜、病理模型難復刻等痛點，體外細胞與分子水平藥效評價是化合物早期篩選、機制解析的核心關(guān)口。標準化、高通量的細胞分子檢測，可在研發(fā)早期快速剔除無效、毒性化合物，大幅降低動物實驗成本，為中樞神經(jīng)藥物從先導分子到臨床前研究提供扎實、可重復的體外數(shù)據(jù)依據(jù)。

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一、神經(jīng)元存活與細胞損傷保護檢測

針對缺血缺氧、毒性蛋白誘導的神經(jīng)元損傷模型，是腦卒中、神經(jīng)退行性藥物初篩基礎(chǔ)手段。

1.細胞活力與細胞損傷定量

采用 CCK-8 比色法檢測活細胞數(shù)量，LDH 釋放實驗定量細胞膜破損程度，多用于 OGD 缺氧缺糖卒中細胞模型、Aβ/Tau 蛋白誘導退變模型，直觀對比受試藥物降低神經(jīng)元損傷的保護效果。

2.神經(jīng)元凋亡水平檢測

流式細胞術(shù) Annexin V/PI 雙染區(qū)分早期、晚期凋亡細胞；同步檢測 Caspase-3、Caspase-9 蛋白酶活性，從細胞層面驗證藥物抑制神經(jīng)元凋亡的作用機制，區(qū)分抗凋亡、抗氧化兩類神經(jīng)保護通路。

UA-Glo® Caspases 3/7 細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：UA079012）用于定量檢測細胞中Caspases 3和7的活性。將該試劑加入待測細胞后，細胞裂解釋出的Caspases 3/7切割試劑中的Caspases 3/7特異性的多肽熒光素偶聯(lián)底物從而釋出熒光素，試劑中的熒光素酶可以催化熒光素反應而產(chǎn)生光，光的強度和Caspases 3/7的活性成正比關(guān)系。該試劑具有信噪比高、重復性好、穩(wěn)定性好的特點。均質(zhì)即用型的配方減少了實驗準備和操作步驟，降低了因為多次加樣導致的誤差，且其穩(wěn)定的輝光信號使該產(chǎn)品尤其適合高通量的化合物篩選。

圖：UA-Glo® Caspases 3/7 細胞凋亡檢測試劑盒驗證實驗數(shù)據(jù)

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Caspases3/7細胞凋亡檢測試劑檢測化合物Staurosporine(STSP)對HeLa細胞凋亡的作用：4x105/ml 的HeLa細胞接種于96孔白板透明底培養(yǎng)板，100µl/孔。24小時后加入3倍稀釋的STSP，37℃5%CO2孵育6hr后按照Caspases3/7細胞凋亡檢測試劑的說明進行Caspases3/7活性檢測。上圖示加入檢測試劑后30min-130min讀取熒光值的劑量曲線，表格為計算所得的EC50值。

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二、氧化應激與線粒體功能檢測（卒中管線核心評價指標）

氧化自由基過量堆積、線粒體功能紊亂是急性腦損傷核心病理機制，也是先必新類神經(jīng)保護藥物重點評價方向。

1.氧化應激標志物定量

熒光探針檢測細胞內(nèi) ROS 活性氧水平；生化法檢測 MDA 丙二醛、SOD 超氧化物歧化酶、GSH-Px 谷胱甘肽過氧化物酶，評價受試藥物自由基清除、抗氧化能力。

2.線粒體功能完整性評價

JC-1 熒光探針檢測線粒體膜電位變化，結(jié)合細胞內(nèi) ATP 含量測定，判斷藥物是否可維持神經(jīng)元線粒體穩(wěn)態(tài)，減少能量代謝衰竭帶來的繼發(fā)腦損傷。

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三、神經(jīng)炎癥通路檢測（膠質(zhì)細胞活化專屬評價體系）

神經(jīng)炎癥貫穿急性卒中恢復期與阿爾茨海默病全病程，實驗室構(gòu)建神經(jīng)元 - 星形膠質(zhì)細胞 - 小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系，配套全套分子檢測方法。

1.炎癥因子定量檢測

qRT-PCR 檢測 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎基因 mRNA 表達水平；細胞上清 ELISA、化學發(fā)光法、TR-FRET批量定量蛋白分泌量，高通量篩選具備中樞抗炎活性的候選分子。

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THUNDER TR-FRET細胞因子檢測

Human TNFα

THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的TNFα 抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與細胞上清中TNFα 結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強度與TNFα 濃度成正比。

全程僅需2h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖：Human TNFα 檢測原理，流程

Human TNFα 檢測范圍：13 – 30,000 pg/mL

圖：Human TNFα 標曲

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Mouse IL1β

THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的mouse IL1β 抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與樣品中IL1β 結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強度與IL1β 濃度成正比。全程僅需3h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖：Mouse IL1β 檢測原理，流程

Mouse IL1β 檢測范圍：31 – 10,000 pg/mL

圖：Mouse IL1β 標曲

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Human IL18

THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，標記熒光供體和受體的mouse IL1β 抗體Eu-Ab1和FR-Ab2，分別與樣品中IL1β 結(jié)合，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強度與IL1β 濃度成正比。全程僅需3h，免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖：Human IL18 檢測原理，流程

Human IL18 檢測范圍：36 – 30,000 pg/mL

圖：Human IL18 標曲

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HICA細胞因子檢測

Human IL1β

試劑盒采用雙抗體夾心的均相發(fā)光法進行hIL-1β濃度的檢測。均相化學發(fā)光是基于供受體微球近距離傳遞能量發(fā)光的均相免疫分析方法。

它采用受體微球交聯(lián)F結(jié)合物，供體微球交聯(lián)鏈霉親和素，F(xiàn)標記hIL-1β抗體1和生物素標記hIL-1β抗體2。兩種標記抗體、受體微球與待測物混合孵育，形成雙抗體夾心免疫復合物，再與供體微球交聯(lián)形成發(fā)光復合物。當兩種微球的間距小于200nm，經(jīng)激發(fā)光照射后，供體微球產(chǎn)生單線態(tài)氧并擴散至受體微球，受體微球接受能量產(chǎn)生發(fā)射光。通過感光元件收集光信號，采用數(shù)學擬合計算待測物中hIL-1β的濃度。當待測物中不含hIL-1β時，無免疫復合物的形成，兩種微球的間距大于200nm， 超出單線態(tài)氧的傳遞距離，則受體微球不產(chǎn)生發(fā)射光。

HICA檢測適用于普通及復雜樣本，如：細胞、血液、腦脊液等。每個檢測僅需2μl樣本量。HICA檢測范圍寬，靈敏度比肩MSD，操作簡便，是高通量篩選的不二之選。

Human IL1β 檢測范圍：0.32~3000 pg/mL

圖：HICA Human IL1β檢測原理及完整標準曲線示例

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2.膠質(zhì)細胞活化形態(tài)學鑒定

免疫熒光共聚焦染色標記 Iba1（小膠質(zhì)細胞標志物）、GFAP（星形膠質(zhì)細胞標志物），定性觀察膠質(zhì)細胞過度活化、增殖狀態(tài)，定量分析藥物抑制神經(jīng)炎癥浸潤的效果。

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四、受體、離子通道功能檢測（睡眠、癲癇類中樞藥物核心技術(shù)）

針對失眠管線雙食欲素受體拮抗劑、離子通道調(diào)控類候選藥物，建立靶向結(jié)合與功能驗證平臺。

1.靶點受體親和力測定

放射性配體結(jié)合實驗、熒光標記競爭性結(jié)合分析，精準測定化合物對 OX1/OX2 食欲素受體、中樞 GPCR 靶點的拮抗 / 激動親和力，快速淘汰結(jié)合活性弱的化合物。

2.膜片鉗電生理功能記錄

全細胞膜片鉗記錄神經(jīng)元動作電位、鈣 / 鉀離子通道電流變化，從電生理層面評價藥物對中樞離子通道的調(diào)控作用，提前預判鎮(zhèn)靜、興奮、致驚厥相關(guān)活性。

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五、突觸可塑性與神經(jīng)修復相關(guān)分子檢測

用于阿爾茨海默病、卒中后認知修復類藥物機制研究，評估藥物促進神經(jīng)重塑的潛力。

1.神經(jīng)元鈣信號動態(tài)監(jiān)測

Fluo-4 AM 鈣離子熒光成像，實時捕捉神經(jīng)元鈣信號傳導強度與頻率，反映突觸信號傳遞功能強弱。

2.突觸結(jié)構(gòu)與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白檢測

免疫熒光標記 MAP2（神經(jīng)元骨架）、PSD95（突觸后膜蛋白），統(tǒng)計突觸密度；Western blot 半定量檢測 BDNF、NGF 神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，驗證藥物促進突觸修復、營養(yǎng)神經(jīng)的作用。

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六、配套輔助分子檢測技術(shù)（標準化支撐平臺）

1.蛋白表達定量：TR-FRET

檢測凋亡、炎癥、線粒體、神經(jīng)修復全通路關(guān)鍵蛋白，解析藥物上下游分子調(diào)控通路。

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THUNDER™ Phospho-STAT3 (Y705) TR-FRET 檢測試劑盒

THUNDER細胞因子檢測是基于雙抗體夾心法，兩個標記了熒光Eu和FR的抗體分別識別蛋白磷酸化蛋白表位和穩(wěn)定區(qū)表位，產(chǎn)生能量共振轉(zhuǎn)移FRET（615nm），進而產(chǎn)生665nm熒光信號，熒光信號強度與磷酸化蛋白濃度成正比。免洗，可高通量。檢測靈敏度高，上限寬。

圖：THUNDER™ Phospho-STAT3 (Y705) 檢測原理，流程

圖：THUNDER™ Phospho-STAT3 (Y705) 檢測數(shù)據(jù)

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2.液相色譜 - 質(zhì)譜 LC-MS/MS

定量細胞跨膜藥物濃度、胞內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸、GABA、食欲素），同步評價化合物體外血腦屏障穿透潛力。

3.高通量 qPCR 多基因篩查

一次性批量檢測損傷、修復、炎癥相關(guān)數(shù)十種基因表達，快速鎖定藥物潛在作用通路。

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