?核心：區(qū)分凋亡（主動(dòng)、無炎癥、凋亡小體）vs 壞死（被動(dòng)、炎癥）

?染料：DNA特異性藍(lán)色熒光染料染細(xì)胞核

正常細(xì)胞 = 淡藍(lán)均勻熒光

凋亡細(xì)胞 = 核固縮、熒光高亮、凋亡小體

??實(shí)驗(yàn)流程：鋪板→yao誘導(dǎo)凋亡→固定→染色→熒光鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

1.掌握細(xì)胞凋亡的核心概念、形態(tài)特征與生理病理意義，區(qū)分細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的本質(zhì)差異。

2.熟練掌握常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)原理與操作流程。3.觀察正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異，識(shí)別典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，初步學(xué)會(huì)凋亡細(xì)胞的判定與結(jié)果分析。4.理解藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，建立細(xì)胞水平的程序性死亡實(shí)驗(yàn)認(rèn)知。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的主動(dòng)程序性out，具有核固縮、染色質(zhì)凝聚、核碎裂、形成凋亡小體等特征，無內(nèi)容物外泄、不引起炎癥，與被動(dòng)損傷導(dǎo)致的細(xì)胞壞死不同。DNA特異性藍(lán)色熒光染料，可穿透活細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色熒光;凋亡細(xì)胞核固縮、染色加深、熒光高亮，可見凋亡小體。本實(shí)驗(yàn)通過藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，利用熒光染色觀察并判定細(xì)胞凋亡情況。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.細(xì)胞鋪板培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2次，加入胰蛋白酶消化，待細(xì)胞形態(tài)變圓、輕微脫壁后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打制成均勻細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度為5x104個(gè)/mL，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

2.細(xì)胞凋亡模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩組:空白對(duì)照組(正常培養(yǎng)細(xì)胞)、凋亡誘導(dǎo)組(加入適宜濃度凋亡誘導(dǎo)劑)。棄去培養(yǎng)皿中舊培養(yǎng)基，對(duì)照組更換新鮮完全培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組更換含凋亡誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.細(xì)胞固定處理

培養(yǎng)結(jié)束后，棄去各組培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕柔清洗細(xì)胞3次，每次3min，去除殘留培養(yǎng)基與雜質(zhì)。每皿加入適量4%多聚甲醛，室溫固定15min，固定完成后棄去固定液，再次用PBS清洗3次，去除殘留固定液，避免影響染色效果。

4.熒光染色

向各組細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入足量DNA特異性藍(lán)色熒光染料染色液，完全覆蓋細(xì)胞層，置于避光孵育盒中室溫避光染色15-20min。染色結(jié)束后，棄去染色液，PBS輕柔清洗2次，洗去游離染料，減少背景熒光干擾。

5.顯微觀察與拍照

將處理好的細(xì)胞樣本置于倒置熒光顯微鏡下，先以低倍鏡觀察整體細(xì)胞分布，再切換高倍鏡，分別觀察對(duì)照組與誘導(dǎo)組細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)、熒光分布特征，選取典型視野拍照記錄，對(duì)比兩組細(xì)胞差異。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.空白對(duì)照組

對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整、分布均勻，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，呈均勻淡藍(lán)色熒光，無核固縮、核碎裂及凋亡小體，幾乎無凋亡細(xì)胞。

2.凋亡誘導(dǎo)組

誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡特征:細(xì)胞皺縮、體積變小，細(xì)胞核固縮，熒光明顯增亮加深，可見核碎裂和凋亡小體，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象顯著。