會(huì)發(fā)生互相干擾，但通過合理優(yōu)化體系和引物設(shè)計(jì)可以控制在可接受范圍?，多重PCR的干擾是多因素共同作用的結(jié)果，具體機(jī)制、影響因素和解決方法如下：

一、多重PCR靶標(biāo)間干擾的核心機(jī)制

多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，干擾主要來(lái)自4個(gè)方面：

1.引物間的相互作用（最主要原因）

多個(gè)引物同時(shí)存在于同一個(gè)反應(yīng)體系中，很容易發(fā)生非特異性結(jié)合：

引物二聚體/多聚體形成?：不同引物的3'端互補(bǔ)、或者存在連續(xù)互補(bǔ)堿基，會(huì)互相結(jié)合形成二聚體，占用引物和聚合酶資源，導(dǎo)致部分靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降甚至完全擴(kuò)不出來(lái)；

引物非特異性結(jié)合?：引物可能結(jié)合到其他引物序列、或者其他靶標(biāo)序列的同源區(qū)域，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，消耗反應(yīng)原料，干擾目標(biāo)條帶擴(kuò)增。

2.擴(kuò)增競(jìng)爭(zhēng)（核心影響因素）

PCR是指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，不同靶標(biāo)的擴(kuò)增效率不同，?擴(kuò)增效率高的靶標(biāo)會(huì)優(yōu)先消耗dNTP、引物、聚合酶等有限的反應(yīng)原料?，最終導(dǎo)致擴(kuò)增效率低的靶標(biāo)被抑制，出現(xiàn)“強(qiáng)靶標(biāo)越擴(kuò)越強(qiáng)、弱靶標(biāo)越擴(kuò)越弱”的偏倚現(xiàn)象：

尤其當(dāng)不同靶標(biāo)濃度差異大（比如檢測(cè)致病菌時(shí)，病原菌濃度遠(yuǎn)低于宿主基因組背景），低濃度靶標(biāo)很容易被高濃度靶標(biāo)完全抑制；

片段大小差異大的靶標(biāo)也容易競(jìng)爭(zhēng)：短片段擴(kuò)增速率比長(zhǎng)片段快，會(huì)優(yōu)先消耗原料，抑制長(zhǎng)片段擴(kuò)增。

3.聚合酶的負(fù)載飽和

一個(gè)反應(yīng)體系中Taq酶的數(shù)量是固定的，多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)延伸時(shí)，聚合酶數(shù)量不足會(huì)導(dǎo)致所有靶標(biāo)的擴(kuò)增效率都下降，整體擴(kuò)增信號(hào)變?nèi)酢?/span>

4.退火溫度沖突

不同引物的最適退火溫度不同，單一統(tǒng)一的退火溫度無(wú)法讓所有引物都達(dá)到最優(yōu)擴(kuò)增效率，部分引物擴(kuò)增效率低，表現(xiàn)為擴(kuò)增被抑制。

二、不同靶標(biāo)數(shù)量的干擾程度差異

三、避免多重PCR靶標(biāo)干擾的優(yōu)化方案

商業(yè)化多重PCR試劑盒，一般都會(huì)通過以下步驟提前優(yōu)化，把干擾控制到極低水平，常規(guī)使用不會(huì)影響結(jié)果：

1.引物設(shè)計(jì)階段主動(dòng)規(guī)避干擾

引物特異性篩選：所有引物做BLAST比對(duì)，避免和其他引物、其他靶標(biāo)序列互補(bǔ)；用軟件預(yù)測(cè)二聚體，控制引物間互補(bǔ)堿基不超過3個(gè)，3'端互補(bǔ)不超過1個(gè)；

引物Tm值統(tǒng)一：所有引物的Tm值控制在?58-62℃范圍內(nèi)，差異不超過2℃?，保證統(tǒng)一退火溫度下所有引物擴(kuò)增效率一致；

產(chǎn)物長(zhǎng)度差異化設(shè)計(jì)：不同靶標(biāo)的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差異控制在50-100bp以上，方便電泳區(qū)分，同時(shí)避免短片段過度競(jìng)爭(zhēng)長(zhǎng)片段。

2.反應(yīng)體系優(yōu)化，平衡擴(kuò)增效率

調(diào)整引物濃度?：對(duì)擴(kuò)增效率低的靶標(biāo)適當(dāng)提高引物濃度，擴(kuò)增效率過高的靶標(biāo)降低引物濃度（一般引物終濃度控制在0.1-0.4μM之間，避免過高濃度增加二聚體）；

優(yōu)化反應(yīng)緩沖液：提高dNTP、Mg²+濃度，滿足多個(gè)靶標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增的原料需求；添加BSA、DMSO、甘油等添加劑，減少引物二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體形成；

使用高活性熱啟動(dòng)Taq酶：熱啟動(dòng)酶避免常溫下引物非特異性延伸，減少非特異性擴(kuò)增消耗，提升整體擴(kuò)增效率，降低干擾。

3.擴(kuò)增程序優(yōu)化，適配多重?cái)U(kuò)增

采用 touchdown PCR（降落PCR）?：退火溫度從高到低逐漸下降，保證特異性高的引物先擴(kuò)增，減少非特異性結(jié)合；

適當(dāng)延長(zhǎng)延伸時(shí)間：多個(gè)產(chǎn)物同時(shí)延伸，比單PCR延長(zhǎng)10-30%的延伸時(shí)間，保證所有產(chǎn)物都能完整延伸；

適當(dāng)增加循環(huán)次數(shù)：彌補(bǔ)整體擴(kuò)增效率下降，一般比單PCR多2-5個(gè)循環(huán)。

4.模板用量調(diào)整

模板濃度過高會(huì)增加非特異性擴(kuò)增和競(jìng)爭(zhēng)，過低會(huì)導(dǎo)致低豐度靶標(biāo)擴(kuò)不出來(lái)，一般多重PCR模板用量控制在?單PCR的1-2倍?即可，不要過度增加模板。

四、哪些情況仍然會(huì)出現(xiàn)明顯干擾？

如果試劑盒優(yōu)化不到位，或者使用不當(dāng)，仍然會(huì)出現(xiàn)明顯干擾：

模板中靶標(biāo)濃度差異過大（超過1000倍），低濃度靶標(biāo)會(huì)被高濃度靶標(biāo)抑制；

引物設(shè)計(jì)不合格，多個(gè)引物間存在較強(qiáng)互補(bǔ)，引物二聚體嚴(yán)重，所有靶標(biāo)擴(kuò)增都受影響；

模板質(zhì)量差（比如降解、有抑制劑），本身擴(kuò)增效率低，多重?cái)U(kuò)增會(huì)放大抑制效應(yīng)；

超過10重以上的超高多重PCR，即使優(yōu)化后仍然會(huì)有部分靶標(biāo)擴(kuò)增效率下降，需要測(cè)序后生物信息學(xué)校正。