? ? ? ?幾乎所有對蛋白質功能、表達、定位、修飾和相互作用的研究，都始于一個關鍵步驟：將蛋白質從其復雜的細胞或組織環(huán)境中釋放出來，即細胞裂解與蛋白質提取。一個成功的裂解方案必須實現(xiàn)兩個看似矛盾的目標：其一，要足夠“暴力”，能夠徹底打破細胞膜、細胞壁（對于植物和某些微生物）以及組織基質的屏障；其二，又要足夠“溫和”，可以最大限度地保護目標蛋白質免于降解、變性、氧化或非特異性聚集，從而保持其天然的結構和生物活性。
然而，生物樣本的多樣性為這一過程帶來了巨大的挑戰(zhàn)。堅韌的植物細胞壁、富含結締組織的動物肌肉、充滿高豐度干擾蛋白的血液樣本，以及脆弱的培養(yǎng)細胞，其物理和化學性質迥異，決定了不存在一種“萬能”的裂解方案。不恰當的方案可能導致蛋白質產量低下、特定類型的蛋白質（如膜蛋白、核蛋白）提取不完全、蛋白質被內源性蛋白酶降解，或產生與下游分析技術不兼容的裂解產物。
細胞裂解和蛋白質提取是研究細胞蛋白質的關鍵步驟，為蛋白質印跡、酶活性測定和質譜分析等眾多下游應用奠定了基礎。
一、通用裂解基礎原則
全程低溫：所有操作在冰上進行，裂解液預冷，防止蛋白降解。
2. 抑制劑及時添加：使用前新鮮加入蛋白酶抑制劑（PMSF、蛋白酶抑制劑 cocktail），研究磷酸化蛋白需加磷酸酶抑制劑（釩酸鈉、氟化鈉、β- 甘油磷酸鈉）。
3. 機械破碎輔助：組織樣本僅靠裂解液無法充分釋放蛋白，需配合研磨、超聲、勻漿儀等物理手段。
4. 裂解時間控制：冰上裂解 30~60 min，避免過長時間導致蛋白降解。
5. 離心澄清：裂解后 12000~14000 g，4℃離心 10~15 min，取上清即為總蛋白。
EnkiLife(恩璣生命)大分子蛋白專用細胞/組織裂解液（Cat#:RC0005）:
? 完整抽提大分子蛋白質。
? 保護蛋白質翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化）。
? 一步到位，無需添加酶抑制劑。
? 兼容細胞與組織樣本。
驗證數據: 樣本兼容性實驗
圖A：使用RC0005裂解 HeLa 細胞和小鼠大腦組織（各2組樣本），用mTOR (289 kDa)抗體對裂解物進行免疫印跡，裂解物上樣量為50μg。
圖B：使用RC0005裂解 HeLa 細胞和小鼠大腦組織（各2組樣本），用GAPDH(37kDa)抗體對裂解物進行免疫印跡，裂解物上樣量為50μg。
數據顯示RC0005對細胞樣本和組織樣本均有優(yōu)秀的裂解效果，同時兼容不同大小的蛋白樣本。
二、細胞樣本裂解
細胞樣本結構簡單，無細胞外基質阻礙，裂解難度最低，分為貼壁細胞與懸浮細胞兩類。
1.貼壁細胞樣本（HeLa、293T、腫瘤細胞等）
裂解液推薦
RIPA（強，完全裂解）或NP-40（溫和，保留復合物）
離心條件
12,000-14,000 rpm，4°C，15 min，收集上清
Tips
可直接在培養(yǎng)皿中裂解（加裂解液后刮?。?/div>
2. 懸浮細胞
樣本處理
離心收集（500-1000 rpm，5 min）；PBS洗滌1-2次
裂解方式
冰上孵育30 min，期間每 10 min 用移液器反復吹打數次，確保細胞完全裂解
三、動物組織裂解
動物組織因細胞外基質豐富、組織致密程度差異極大，需根據組織特性選擇破碎方式與裂解液強度。核心原則：越致密、纖維越多的組織，機械破碎強度越高；酶活性越高的組織，抑制劑越要足量。
1. 腦組織
樣本特點
脂質含量極高（髓鞘豐富），蛋白豐度中等，內源蛋白酶活性中等，質地偏軟
樣本處理
新鮮取材后立即置于冰上；去除腦膜和血管；可分區(qū)（皮層、海馬、小腦等）
裂解液推薦
含 1% SDS 的強 RIPA 裂解液（增強膜蛋白溶解）
離心條件
12,000-14,000 rpm，4°C，15-20分鐘，取中間澄清層（避開上層脂質層和下層沉淀）
Tips
腦組織脂質多，離心后上層會有白色脂層，取樣時務必避開，否則會影響后續(xù) WB實驗
2. 肝臟組織
樣本特點
蛋白含量極高，內源蛋白酶、磷酸酶活性極強，質地松軟易破碎。
樣本處理
去除膽囊和結締組織；PBS 沖洗去除血液，濾紙吸干
裂解液推薦
常規(guī) RIPA + 雙倍劑量蛋白酶 / 磷酸酶抑制劑
裂解方式
冰上裂解 30 min，間歇渦旋2-3 次
離心條件
12,000-14,000 rpm，4°C，15分鐘，取上清
Tips
（1）肝臟蛋白酶活性極強，PMSF 需臨用前添加，且濃度提高至 2 mM。
（2）血液會干擾蛋白定量，務必用 PBS 充分灌流或沖洗干凈。
（3）肝臟蛋白濃度高，后續(xù)定量時需加大稀釋倍數。
3. 心臟/肌肉組織
樣本特點
肌纖維豐富、組織致密，機械強度高，普通勻漿難以充分破碎；線粒體蛋白豐富
離心條件
12,000-14,000 rpm，4°C，20分鐘
Tips
（1）液氮研磨是肌肉組織最有效的破碎方式，研磨不充分會導致得率極低。
（2）超聲避免產生泡沫，防止蛋白氧化變性。
4. 腎臟組織
樣本特點
血管網絡密集，血液殘留量大；皮質（腎小球、腎小管為主）與髓質蛋白表達譜差異顯著；組織質地偏韌，細胞外基質含量中等；內源蛋白酶、磷酸酶活性較強，且含大量膜轉運蛋白、離子通道與受體蛋白。
裂解液推薦
RIPA 裂解液（強）；研究膜轉運蛋白可選用含 1% SDS 的增強型 RIPA
機械破碎
組織勻漿器勻漿直至無明顯肉眼可見固體；質地偏韌的樣本也可先液氮研磨成細粉，再加入裂解液重懸。
裂解方式
冰上裂解 30 min，每 10 min 渦旋混勻一次
離心條件
12,000 rpm，4°C，15-20 min，吸取中間澄清上清，棄去底層細胞碎片沉淀及表層少量脂膜。
Tips
（1）血液殘留是腎臟樣本最核心的干擾因素，會導致白蛋白、血紅蛋白等血液蛋白占比過高，掩蓋內源組織蛋白條帶，務必通過在體灌流或離體反復漂洗充分去除血液。
（2）腎臟皮質與髓質功能、蛋白譜差異極大，實驗設計需明確取材部位；常規(guī)總蛋白提取優(yōu)先選取腎皮質，目標蛋白豐度更高、結果更穩(wěn)定。
（3）腎臟內源磷酸酶活性較高，研究磷酸化修飾蛋白時，需新鮮配制并加入足量磷酸酶抑制劑，全程嚴格低溫操作，避免磷酸化信號衰減。
5. 脂肪組織
樣本特點
脂質占比極高，蛋白含量極低，常規(guī)方法得率差
樣本處理
去除血管和結締組織；盡量去除多余脂肪；PBS 沖洗，剪碎
裂解液推薦
含1-2% SDS的裂解液（脂質需高濃度去污劑）
離心條件
12,000 rpm，4°C，20 min，小心吸取下層水相蛋白溶液，完全棄去上層油脂。必要時用氯仿 - 甲醇法沉淀蛋白，去除殘留脂質
Tips
（1）肪組織蛋白得率低，需加大初始樣本量。
（2）離心后脂層與水相分界明顯，取樣時槍頭穿過脂層時避免帶入油脂。
（3）油脂殘留會導致 SDS-PAGE 電泳條帶彌散、泳道拖尾。
6. 脾臟
樣本特點
血竇系統(tǒng)高度發(fā)達，血液殘留量極大，紅細胞占比高；組織質地松軟，內源蛋白酶與核酸酶活性較強，易出現(xiàn)蛋白降解，血液蛋白易掩蓋內源組織蛋白信號。
樣本處理
脾臟用預冷 PBS 反復沖洗表面，輕柔擠壓排出血竇內殘血，有條件優(yōu)先采用心臟灌注取材以徹底去除血液
離心條件
12,000 rpm，4°C，15-20 min，吸取中間澄清蛋白上清，避開底層細胞碎片與紅細胞沉淀
Tips
（1）嚴控血液污染：灌注取材是最優(yōu)解決方案；若離心后上清仍偏紅，可再次低速離心去除殘留紅細胞。
（2）防范蛋白降解：免疫細胞內源蛋白酶活性高，取材后禁止室溫放置，需立即液氮速凍或全程冰上操作。
7. 腸道組織
樣本特點
（1）結構分層明顯，蛋白譜差異大；
（2）腔內雜質多，污染風險高；
（3）蛋白降解風險極高
樣本處理
按實驗需求截取對應腸段（十二指腸 / 空腸 / 回腸 / 結腸），縱向剪開，去除內容物；PBS輕柔沖洗；可分離黏膜/肌層
機械破碎
（1）黏膜層樣本：組織勻漿器勻漿直至無明顯肉眼可見固體。
（2）全層 / 肌層樣本：液氮中研磨成均勻細粉，再加入裂解液重懸。
裂解條件
冰上靜置裂解 30 min，每 10 min 輕渦旋混勻一次
離心條件
12,000 rpm，4°C，15分鐘，若上清仍渾濁黏稠，可重復離心一次，或經短暫超聲后再次離心。
Tips
（1）黏液干擾，需充分沖洗。
（2）蛋白酶活性高，腸道蛋白酶種類多、活性強，必須搭配廣譜蛋白酶抑制劑 cocktail，PMSF 終濃度可提高至 2 mM。
8. 血液
全血
含紅細胞、白細胞、血小板及血漿蛋白
（1）取 100-200 μL 全血，加入 2-3 倍體積 紅細胞裂解液（如 ACK 裂解液），室溫靜置 5-10 min，裂解紅細胞；
（2）4°C，300×g 離心 5 min，棄上清，保留白細胞沉淀；
（3）用預冷 PBS 洗滌白細胞沉淀 2 次；
（4）加入 RIPA 裂解液（含 1% 蛋白酶抑制劑），按 10? 細胞/100-200 μL 比例；
（5）冰上裂解 30 min，期間每 10 min 渦旋振蕩 1 次；
（6）4°C，12,000×g 離心 15-20 min，取上清即為蛋白提取液。
血清
去除血細胞和纖維蛋白原后的上清
新鮮全血室溫靜置 30~60 min 待充分凝血，3000 g、4℃離心 15 min，小心吸取上層淡黃色澄清血清，避免觸碰中間白細胞層與底層紅細胞。（直接稀釋使用，無需裂解）
血漿
含抗凝劑，保留纖維蛋白原
EDTA 抗凝全血顛倒混勻后，3000 g、4℃離心 15 min，取上層血漿。（直接稀釋使用，無需裂解）
血細胞（PBMC/白細胞）
需裂解紅細胞后分離
1. PBMC 分離（密度梯度離心法）
（1）新鮮 EDTA 抗凝血與等體積 PBS 稀釋混勻，沿管壁緩慢疊加到 Ficoll-Paque 分離液液面上方，保持界面清晰。
（2）2000 g、室溫離心 20 min（升降速調至最低，避免打破界面）。
（3）小心吸取中間乳白色的 PBMC 白膜層，轉移至新離心管，加入 5~10 倍體積預冷 PBS 重懸洗滌。
（4）1500 g、4℃離心 10 min，棄上清；重復洗滌 1~2 次，徹底去除殘留血小板與分離液。
2. 細胞裂解： 按每 1×10?細胞加入 100~200 μL 預冷裂解液，吹打重懸均勻，冰上裂解 30 min，每 10 min 輕渦旋一次。
3. 離心取上清： 14000 g、4℃離心 15 min，吸取中間澄清蛋白上清，棄底層細胞碎片沉淀。
四、植物組織裂解
植物樣本有堅韌的細胞壁，且富含多酚、多糖、次生代謝物，易導致蛋白氧化褐變、沉淀，是裂解難度最高的樣本類型。核心策略：液氮研磨破壁 + 多酚 / 多糖去除手段。且植物樣本極易氧化，建議裂解后1個月內使用完，未裂解的樣本，建議液氮保存長期保存，其次才考慮-80℃保存，注意-20℃保存不要超過1個月。
液氮研磨標準流程
收集
液氮蒸發(fā)后用預冷藥匙轉移粉末
粉末裝入含β-巰基乙醇的離心管
裂解
加入99:1裂解液 + 超聲破碎
無需額外勻漿步驟
離心
12,000-14,000 rpm離心15-20分鐘取上清
底部白色沉淀可冷凍保存?zhèn)溆?/div>
1. 葉片組織
樣本特點
細胞壁較薄，易研磨；葉綠體豐富，Rubisco（核酮糖二磷酸羧化酶）占比極高，易掩蓋低豐度蛋白；多酚含量中等
裂解液推薦
植物 RIPA + 1% PVP + 10 mM β- 巰基乙醇
離心條件
12,000-14,000 rpm，4°C，15-20分鐘,取上清；若上清仍有色素，可重復離心一次
Tips
（1）去除高豐度 Rubisco 可使用專門的植物蛋白富集試劑盒，提升低豐度蛋白檢測靈敏度。
（2）幼嫩葉片比老葉更容易提取，蛋白完整性更好。
（3）葉綠素等色素會干擾 BCA 定量，建議用 Bradford 法或 2-D 定量試劑盒。
2.根組織
樣本特點
纖維豐富，雜質多，多糖和次生代謝物含量高，易褐變；根表土壤易污染樣本
裂解液推薦
含 2% PVP、5% 甘油的裂解液，配合 TCA - 丙酮沉淀純化
Tips
（1）根系樣本雜質多，直接裂解的樣品雜質含量高，嚴重影響電泳質量，建議 TCA - 丙酮沉淀純化。
（2）幼根比老根蛋白含量高、木質化程度低，優(yōu)先選取根尖部位。
3.莖/枝干組織
樣本特點
木質化程度高，纖維多，細胞壁厚且堅硬，研磨難度大；蛋白含量低于葉片
Tips
（1）木質化莖稈務必充分研磨，肉眼看不到纖維顆粒才算合格。
（2）加熱輔助裂解可顯著提高蛋白得率，但不適用于需要保持蛋白天然活性的實驗。
4. 花
樣本特點
花是植物繁殖器官中結構異質性最強、次生代謝物干擾最嚴重的類型之一，核心裂解難點集中在褐變控制與低豐度蛋白富集
樣本處理
新鮮取材后立即置于冰上，根據實驗需求分離目標部位（如僅取花瓣、雄蕊或雌蕊），去除枯萎組織與表面雜質。用預冷蒸餾水快速沖洗 1 次，濾紙吸干表面水分，全程減少室溫暴露
蛋白裂解方法一
直接裂解法（適用于花蕊、花柄等褐變較輕的部位）：
（1）按 1:5~1:8（質量：體積）加入預冷裂解液，快速渦旋混勻后立即置于冰上。
冰上裂解 30 min，每 10 min 輕渦旋混勻一次。
（2）14000 g、4℃離心 20 min，吸取中間澄清蛋白上清，棄去底部細胞碎片與表層色素漂浮層。
（3）若上清仍有明顯顏色，可加入少量 PVPP 吸附多酚，再次離心澄清。
蛋白裂解方法二
TCA - 丙酮沉淀法（花瓣等高色素樣本首選）：
（1）研磨粉末轉移至預冷 EP 管，加入 3 倍體積的預冷 10% TCA - 丙酮溶液（含 0.07% β- 巰基乙醇），充分混勻。
（2）-20℃沉淀 2 h 以上（或過夜），期間顛倒混勻 1~2 次。
（3）12000 g、4℃離心 15 min，棄上清。· 用 80% 預冷丙酮洗滌沉淀 3 次，每次離心后徹底棄上清，去除殘留 TCA。
（4）室溫通風處風干 5~10 min 至無丙酮氣味（不可過度干燥，否則蛋白難以復溶）。
（5）加入適量裂解液渦旋重懸，冰上孵育 30 min 助溶。
（6）14000 g 離心 15 min，取上清即為純化后的蛋白樣品。
5. 種子
樣本特點
堅硬種皮破壁、高含量儲存雜質去除，以及內源酶活化導致的蛋白降解
樣本處理
根據實驗需求去除種皮，分離胚、胚乳等目標部位；蒸餾水快速沖洗表面灰塵，濾紙吸干水分。干燥種子直接液氮研磨，嚴禁浸泡水化，防止內源酶活化降解蛋白
裂解液推薦
1. 淀粉 / 蛋白類種子：含 2% SDS 的強裂解液或植物強 RIPA 裂解液；高純度需求搭配 TCA - 丙酮沉淀純化。
2. 油料種子：強 RIPA 裂解液，必須搭配正己烷 / 石油醚脫脂預處理。
蛋白裂解方法一
淀粉 / 蛋白類種子（水稻、小麥、豆類等）：(1) 按 1:10（質量：體積）加入預冷裂解液，快速渦旋混勻，冰上裂解 30 min，每 10 min 渦旋一次。
(2) 14000 g、4℃離心 20 min，吸取中間澄清上清；若下層淀粉沉淀厚重，可重復離心一次去除殘留淀粉顆粒。
(3) 高純度實驗需求：研磨后直接用 10% TCA - 丙酮溶液沉淀蛋白，步驟同花組織沉淀法，可徹底去除淀粉、多糖與多酚雜質。
蛋白裂解方法二
油料種子（花生、油菜籽、芝麻等）：
(1) 研磨粉末加入預冷正己烷（或石油醚），渦旋混勻后靜置 10 min，12000 g 離心 5 min 棄上清；重復脫脂 2~3 次。
(2) 通風處風干至無有機溶劑殘留（約 5 min），避免有機溶劑導致蛋白變性。
(3) 加入預冷強 RIPA 裂解液，渦旋混勻，冰上裂解 30 min。· 14000 g、4℃離心 20 min，小心吸取下層水相蛋白溶液，徹底避開表層殘留油脂。
五、RIPA裂解專屬關鍵注意事項（避坑重點）
1. 抑制劑必須現(xiàn)加：PMSF在水溶液中極易降解，必須臨用前加入RIPA，不可提前配制儲存。
3. 低溫操作：全程冰上/4℃操作，RIPA裂解過程產熱會導致蛋白降解、磷酸化位點丟失。
4. 樣本比例勿過量：組織/細胞過多、裂解液不足，會導致裂解不完全、蛋白濃度偏低、雜質過多。
5. 上清取用規(guī)范：離心后僅取清亮上清，堅決避免吸取油脂、沉淀，防止后續(xù)WB條帶雜帶、背景臟。
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