一、研究背景

突觸前精準(zhǔn)、快速的神經(jīng)遞質(zhì)釋放高度依賴 SNARE 復(fù)合物介導(dǎo)的突觸胞吐過(guò)程，Syntaxin-1、SNAP25、VAMP2 三種核心 SNARE 蛋白相互結(jié)合形成四螺旋反式 SNARE 復(fù)合體，拉近囊泡與細(xì)胞膜距離并啟動(dòng)膜融合進(jìn)程，SNAP25 結(jié)構(gòu)異常、基因突變會(huì)直接破壞突觸信號(hào)傳導(dǎo)，臨床中大量發(fā)育性癲癇性腦?。―EE）患者體內(nèi)均檢出 SNAP25 雜合突變。既往顯微成像研究已經(jīng)觀測(cè)到 SNAP25 與 Syntaxin-1 會(huì)在突觸膜形成納米尺度蛋白簇，這種聚集狀態(tài)直接影響囊拴縛、錨定與啟動(dòng)釋放，但長(zhǎng)期沒(méi)有研究解釋蛋白成簇的分子驅(qū)動(dòng)力；液液相分離（LLPS）作為細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜區(qū)室的組裝方式，已被證實(shí)調(diào)控突觸支架蛋白、突觸結(jié)合蛋白 1 的空間聚集，而作為膜融合核心的 SNARE 蛋白是否依靠相分離實(shí)現(xiàn)局部富集始終是領(lǐng)域空白。Min Zhu、Yinghui Liu、Haijia Yu 團(tuán)隊(duì)于 2026 年在《Cell Reports》發(fā)表題為SNAP25 undergoes phase separation to facilitate the synaptic vesicle fusion machinery的研究，該文結(jié)合 SNAP25 獨(dú)特分子結(jié)構(gòu) —— 兩段 SNARE 基序之間存在大片內(nèi)在無(wú)序連接區(qū)，且連接區(qū)半胱氨酸可發(fā)生棕櫚?；揎?，結(jié)合前人 Syntaxin-1 可增強(qiáng) SNAP25 棕櫚?；膶?shí)驗(yàn)結(jié)論，提出完整科學(xué)假設(shè)：SNAP25 依靠無(wú)序連接區(qū)發(fā)生液液相分離，棕櫚?；揎棥yntaxin-1 共同調(diào)控凝聚物形成，相分離產(chǎn)生的液滴可招募全部 SNARE 組分，促進(jìn)三元復(fù)合體組裝，DEE 致病突變會(huì)破壞相分離并阻斷膜融合通路，以此完整填補(bǔ) SNARE 蛋白聚集機(jī)制的研究缺口。

二、研究方法

該研究整合體外生化重構(gòu)、活細(xì)胞光學(xué)檢測(cè)、原代神經(jīng)元模型、人工膜系統(tǒng)多重實(shí)驗(yàn)體系，實(shí)驗(yàn)材料涵蓋原核表達(dá)純化的野生型與系列突變 SNAP2、Syntaxin-1 胞內(nèi)段、VAMP2 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域蛋白，同時(shí)構(gòu)建多種熒光標(biāo)記融合蛋白、光誘導(dǎo)相分離 OptoDroplet 質(zhì)粒、SNAP25 與棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 ZDHHC17 靶向慢病毒干擾載體；體外實(shí)驗(yàn)搭建標(biāo)準(zhǔn)化相分離反應(yīng)體系，利用熒光共聚焦、DIC 微分干涉成像觀察液滴形態(tài)，借助沉降實(shí)驗(yàn)、濁度定量、圓二色譜、雙溴甲烷色氨酸淬滅表征蛋白相分離與構(gòu)象變化；細(xì)胞層面采用 HeLa 細(xì)胞敲低回補(bǔ)體系排除過(guò)表達(dá)干擾，依托 FRAP 熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證凝聚物液態(tài)動(dòng)態(tài)特性，OptoDroplet 光控系統(tǒng)直觀觀測(cè)活細(xì)胞內(nèi)蛋白共凝聚行為；體外膜重構(gòu)部分構(gòu)建平面支撐脂雙層 SLB、巨型單層囊泡 GUV、小型囊泡 SUV 三種人工膜，模擬細(xì)胞膜與突觸囊泡結(jié)構(gòu)，還原膜表面蛋白聚集與囊泡招募過(guò)程；細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)使用大鼠原代海馬神經(jīng)元，通過(guò)免疫印跡驗(yàn)證蛋白表達(dá)量，共聚焦成像觀察神經(jīng)元內(nèi)蛋白點(diǎn)狀聚集；疾病機(jī)制部分構(gòu)建 I67N、I192N 兩種 DEE 相關(guān)突變蛋白，在 293T 細(xì)胞檢測(cè) SDS 耐受型功能性 SNARE 復(fù)合體生成量，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次及以上生物學(xué)重復(fù)，采用 t 檢驗(yàn)、單因素方差分析完成統(tǒng)計(jì)學(xué)差異判定。

三、結(jié)果分析

1. 體外與活細(xì)胞雙重證實(shí) SNAP25 具備液液相分離特性

研究首先通過(guò)蛋白無(wú)序預(yù)測(cè)工具 PrDOS 解析 SNAP25 氨基酸序列，整條蛋白中兩段 SNARE 基序中間的連接區(qū)段存在大范圍內(nèi)在無(wú)序序列，這也是相分離蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征。體外重構(gòu)體系中，純化 EGFP 標(biāo)記 SNAP25 在擁擠劑 PEG 生理模擬環(huán)境下自發(fā)形成球形液滴，延時(shí)成像捕捉到小液滴相互融合的動(dòng)態(tài)畫面，直觀體現(xiàn)液態(tài)屬性；梯度濃度、鹽離子梯度實(shí)驗(yàn)繪制完整相圖，證明蛋白濃度、滲透壓、分子擁擠程度共同調(diào)控相分離發(fā)生，生理鹽水濃度區(qū)間恰好滿足凝聚物形成條件。為排除蛋白過(guò)表達(dá)帶來(lái)的假聚集，研究構(gòu)建 SNAP25 敲低 + 內(nèi)源水平回補(bǔ) HeLa 細(xì)胞，對(duì)照組僅表達(dá)游離 GFP 時(shí)細(xì)胞質(zhì)熒光均勻彌散，而 GFP-SNAP25 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量明亮點(diǎn)狀凝聚物；FRAP 漂白實(shí)驗(yàn)中凝聚物熒光可緩慢恢復(fù)，90 秒達(dá)到半數(shù)恢復(fù)水平，活細(xì)胞延時(shí)拍攝還能觀察點(diǎn)狀凝聚物互相融合，從細(xì)胞層面印證 SNAP25 在生理表達(dá)水平下仍能發(fā)生液相凝聚，內(nèi)外兩套體系相互佐證 SNAP25 固有相分離能力。

2. 無(wú)序連接區(qū)是 SNAP25 相分離的核心必需元件

研究者設(shè)計(jì)系列截短突變體拆解 SNAP25 功能區(qū)段，分別去除 N 端短肽、完整刪除中間連接區(qū)、單獨(dú)提取連接片段開展平行體外相分離實(shí)驗(yàn)。去除 N 端片段的蛋白仍能形成規(guī)整球形液滴，而缺失連接區(qū)的突變體僅產(chǎn)生無(wú)定形絮狀沉淀，單獨(dú)的連接片段甚至比全長(zhǎng)蛋白更易形成大量液滴；沉降與濁度定量數(shù)據(jù)進(jìn)一步量化差異，缺失連接區(qū)蛋白絕大部分留存于上清，幾乎不形成可沉淀凝聚物。光誘導(dǎo) OptoDroplet 系統(tǒng)同步驗(yàn)證該規(guī)律，藍(lán)光刺激下除 ΔL 缺失連接突變體外，其余蛋白均可形成細(xì)胞內(nèi)凝聚顆粒，單獨(dú)連接片段產(chǎn)生的顆粒數(shù)量明顯更多。最后在大鼠原代海馬神經(jīng)元中重復(fù)驗(yàn)證，野生 SNAP25 在神經(jīng)元胞體與突觸區(qū)域形成清晰熒光斑點(diǎn)，缺失連接區(qū)突變蛋白熒光完全均勻擴(kuò)散，高分辨成像與己二醇溶解實(shí)驗(yàn)均證明點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)為典型液相凝聚物，完整證明連接區(qū)是驅(qū)動(dòng) SNAP25 發(fā)生相分離的唯一核心結(jié)構(gòu)。

3. 棕櫚酰化修飾雙向調(diào)控 SNAP25 相分離與膜錨定

連接區(qū)半胱氨酸是棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 ZDHHC17 的修飾位點(diǎn)，研究從細(xì)胞與體外突變兩條路徑驗(yàn)證修飾功能。細(xì)胞層面敲低 ZDHHC1 或加入棕櫚?；种苿?2-BP 后，HeLa 與海馬神經(jīng)元內(nèi) SNAP25 點(diǎn)狀凝聚物大幅減少，蛋白脫離細(xì)胞膜、均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，說(shuō)明棕櫚?；笔е苯悠茐哪畚镄纬膳c膜定位。研究者構(gòu)建兩類定點(diǎn)突變：C85A/C88A 雙突變消除半胱氨酸修飾位點(diǎn)、C88L 單突變模擬棕櫚?；杷?yīng)，體外相分離體系中雙突變液滴尺寸、數(shù)量顯著下降，模擬修飾的 C88L 突變液滴更大更密集；平面脂雙層 SLB 膜重構(gòu)實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)該趨勢(shì)，只有具備棕櫚?；稽c(diǎn)的蛋白才能在膜表面形成高密度蛋白簇，突變蛋白膜聚集能力顯著減弱。原代神經(jīng)元成像同樣匹配體外結(jié)果，C88L 突變保留大量膜上熒光斑點(diǎn)，而雙突變彌散分布，由此證實(shí)棕櫚?；ㄟ^(guò)提升連接區(qū)疏水性，一方面促進(jìn) SNAP25 液相凝聚，另一方面介導(dǎo)凝聚物錨定在突觸細(xì)胞膜上。

4. Syntaxin-1 與 SNAP25 共凝聚并增強(qiáng)相分離效率

將等量 Syntaxin-1 胞質(zhì)段與 SNAP25 混合后，雙色熒光成像可見(jiàn)兩種蛋白完全共定位在同一液滴內(nèi)，液滴體積顯著增大；濁度定量數(shù)值同步上升，F(xiàn)RAP 實(shí)驗(yàn)顯示共凝聚物內(nèi)部蛋白流動(dòng)性下降，圓二色譜證明原本無(wú)序的 SNAP25 在結(jié)合 Syntaxin-1 后轉(zhuǎn)變?yōu)?α 螺旋構(gòu)象，說(shuō)明二者互作引發(fā)蛋白結(jié)構(gòu)折疊。梯度添加 Syntaxin-1 的實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，蛋白沉淀中 SNAP25 占比隨 Syntaxin-1 濃度持續(xù)升高；OptoDroplet 光控共表達(dá)體系中，Syntaxin-1 熒光完全滲入 SNAP25 光誘導(dǎo)凝聚顆粒，皮爾森相關(guān)系數(shù)證明二者高度共定位。人工平面脂雙層體系模擬細(xì)胞膜環(huán)境，膜上固定 Syntaxin-1 后，SNAP25 會(huì)大量聚集形成更大共凝聚斑塊，從溶液與膜兩種環(huán)境證明 Syntaxin-1 可與 SNAP25 發(fā)生共相分離，同時(shí)放大凝聚規(guī)模。

5. SNAP25 凝聚物招募全部 SNARE 組分形成三元共凝集體

體外三色熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，Syntaxin-1、VAMP2 兩種蛋白均可均勻分布在 SNAP25 液滴內(nèi)部，沉降實(shí)驗(yàn)回收的凝聚沉淀可同時(shí)檢出三種 SNARE 蛋白，證明凝聚物具備富集兩種伴侶蛋白的能力。HeLa 細(xì)胞共表達(dá)三種熒光標(biāo)記 SNARE 蛋白時(shí)，細(xì)胞內(nèi)生成巨型融合凝聚體，F(xiàn)RAP 結(jié)果顯示三元共凝集體內(nèi)部蛋白流動(dòng)性大幅降低，提示蛋白間廣泛相互作用；體外等摩爾混合三種蛋白可直接形成大尺寸共凝聚液滴，配套體外 SNARE 組裝實(shí)驗(yàn)證實(shí)相分離環(huán)境下功能性 SNARE 復(fù)合體生成量顯著提升，明確 SNAP25 液滴作為分子支架，同時(shí)捕獲兩類配套 SNARE 蛋白，為四螺旋融合復(fù)合體的組裝提供局部高濃度微環(huán)境。

6. SNAP25 凝聚物吸附細(xì)胞膜、介導(dǎo)突觸囊泡錨定

研究采用 GUV 巨型囊泡模擬突觸前細(xì)胞膜，帶馬來(lái)酰亞胺脂質(zhì)的囊泡可結(jié)合 SNAP25，熒光成像清晰觀察到 SNAP 凝聚物貼附、浸潤(rùn)囊泡表面，若移除馬來(lái)酰亞胺膜結(jié)合位點(diǎn)，液滴無(wú)法吸附膜結(jié)構(gòu)。當(dāng) GUV 膜預(yù)先錨定 Syntaxin-1 時(shí)，加入 SNAP25 會(huì)在膜表面形成大片共凝聚區(qū)域，再加入標(biāo)記 VAMP 小型囊泡 SUV 后，所有囊泡都會(huì)集中富集在膜上 SNARE 共凝聚斑塊內(nèi)，無(wú) SNAP25 時(shí)囊泡無(wú)法錨定在膜表面。對(duì)膜上三元凝聚物開展 FRAP 檢測(cè)，蛋白流動(dòng)性明顯降低，印證膜、三類 SNARE 多重相互作用穩(wěn)定囊拴縛狀態(tài)，完整還原生理過(guò)程：膜錨定的 SNAP25 凝聚物搭建融合平臺(tái)，捕捉攜帶 VAMP2 的突觸囊泡，完成囊泡?？坎襟E。

7. DEE 致病突變破壞相分離、抑制 SNARE 復(fù)合體組裝

選取兩種臨床 DEE 致病突變 I67N、I192N 開展功能驗(yàn)證，同等體外條件下突變蛋白僅能形成微小、稀少液滴，沉降實(shí)驗(yàn)顯示進(jìn)入凝聚沉淀的蛋白量大幅下降；FRAP 曲線證明突變凝聚物內(nèi)部分子運(yùn)動(dòng)受阻，延時(shí)液滴融合成像可見(jiàn)突變小液滴幾乎無(wú)法融合生長(zhǎng)，說(shuō)明突變降低蛋白流動(dòng)性、阻斷液滴融合成熟過(guò)程。細(xì)胞層面共表達(dá)三類 SNARE 蛋白，野生型組可檢出大量耐受 SDS 的功能性 SNARE 復(fù)合物，兩種突變組復(fù)合體含量顯著下調(diào)；三色熒光共轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)，突變 SNAP25 無(wú)法與 Syntaxin-1、VAMP2 形成大型三元共凝集體。該組結(jié)果建立分子病理通路：致病突變損傷 SNAP25 液液相分離能力，破壞三元 SNARE 共凝聚平臺(tái)，最終抑制膜融合機(jī)器組裝，解釋 DEE 患者突觸釋放受損的分子底層機(jī)制。

總結(jié)

本文圍繞突觸囊泡融合核心蛋白 SNAP25 展開系統(tǒng)研究，完整揭示棕櫚酰化修飾調(diào)控的 SNAP25 液液相分離機(jī)制，闡明該過(guò)程在 SNARE 復(fù)合體組裝、突觸囊泡錨定及神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的核心生理功能，并關(guān)聯(lián)發(fā)育性癲癇性腦病的發(fā)病機(jī)理。研究首先通過(guò)體外生化與活細(xì)胞成像證實(shí) SNAP25 能夠發(fā)生液液相分離，蛋白兩段 SNARE 基序之間的內(nèi)在無(wú)序連接區(qū)是實(shí)現(xiàn)相分離的必需結(jié)構(gòu)；連接區(qū)半胱氨酸棕櫚酰化修飾可提升蛋白疏水性，雙重促進(jìn)凝聚體形成與細(xì)胞膜錨定，而 Syntaxin-1 可與 SNAP25 共凝聚，進(jìn)一步放大相分離效應(yīng)并誘導(dǎo) SNAP25 構(gòu)象轉(zhuǎn)變，在膜表面搭建 t-SNARE 富集支架。SNAP25 凝聚體可同步招募 Syntaxin-1 與 VAMP2 形成三元 SNARE 共凝聚體，大幅提升功能性 SNARE 復(fù)合體的組裝效率，人工膜重構(gòu)實(shí)驗(yàn)證明膜結(jié)合的 SNAP25 凝聚體能夠浸潤(rùn)膜界面、捕獲含 VAMP2 的突觸囊泡，解釋神經(jīng)元毫秒級(jí)同步遞質(zhì)釋放依賴局部 SNARE 蛋白富集的分子基礎(chǔ)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩種 DEE 致病突變 I67N、I192N 會(huì)破壞 SNAP25 凝聚體流動(dòng)性、阻斷液滴融合，抑制三元共凝聚體與功能性 SNARE 復(fù)合體生成，從分子層面建立相分離缺陷與神經(jīng)發(fā)育疾病的關(guān)聯(lián)。文章客觀說(shuō)明現(xiàn)有局限，尚未解析 Munc18、Munc13 等關(guān)鍵調(diào)控蛋白對(duì) SNAP25 凝聚體的調(diào)控作用，也缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)佐證生理功能。整體研究填補(bǔ)了 SNARE 核心蛋白相分離調(diào)控突觸胞吐的領(lǐng)域空白，提出無(wú)膜凝聚體調(diào)控快速神經(jīng)元通訊的全新范式，拓展了突觸前分子排布與神經(jīng)遞質(zhì)釋放機(jī)制的認(rèn)知。

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