Knock down技術(shù)簡介：
Knock down（KD，基因敲低）技術(shù)是一類借助分子手段降低目標基因表達水平的研究方法。該技術(shù)基于RNA干擾原理發(fā)揮作用，無需改變基因組DNA序列，僅通過降解目標基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA實現(xiàn)下調(diào)對應蛋白的表達水平，進而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。目前，該技術(shù)已被廣泛應用于基因功能解析、藥物靶點驗證、疾病模型構(gòu)建以及基因治療的前期評估，是現(xiàn)代分子生物學與藥物研發(fā)領(lǐng)域的核心工具之一。
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Knock down技術(shù)原理：
目前Knock down技術(shù)有以下幾種常見的轉(zhuǎn)染方式：
① 直接根據(jù)目標基因的序列，設計并通過化學合成得到對應的雙鏈siRNA，借助脂質(zhì)體等手段直接遞送到細胞內(nèi)，siRNA與RNA誘導沉默復合體結(jié)合，通過堿基互補配對特異性識別目標基因的mRNA，促進mRNA降解或抑制其翻譯過程，從而完成KD效果。
② 構(gòu)建編碼shRNA的質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式整合在宿主細胞的基因組中，細胞內(nèi)表達的shRNA經(jīng)過加工，形成具有活性的siRNA，進而實現(xiàn)穩(wěn)定的基因敲低或沉默效果。
③ CRISPRi：基于CRISPR-Cas9技術(shù)開發(fā)，使用失去DNA剪切能力的dCas9與目的基因結(jié)合，通過物理位置占據(jù)（物理性地阻礙RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合），干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而干擾目的基因的表達。不僅如此，dCas9還可以融合抑制基因表達的結(jié)構(gòu)域，從而進一步加強KD的效果。
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Knock down實驗流程：
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恩璣生命長期根植穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建，在KD穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建上使用基于shRNA載體的成熟RNAi技術(shù)，shRNA設計采用三保一策略，通過抗性或載體熒光嚴格篩選細胞，并通過PCR和WB雙重驗證敲低效率，確保獲得長期有效、重復性強、敲低效率高的細胞系。
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Knock down交付流程：
選擇恩璣的優(yōu)勢：
經(jīng)驗豐富：恩璣生命長期從事穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低細胞系的構(gòu)建，積累了豐富的項目開發(fā)經(jīng)驗，并針對不同細胞開發(fā)了多種不同的載體遞送方式。
細胞優(yōu)良：恩璣生命細胞平臺所有的細胞來源正規(guī)，種類廣泛，覆蓋多種不同的細胞系，人源細胞系均可提供STR驗證。
多重驗證：shRNA采用三保一策略，并同時提供PCR驗證和WB全膜驗證，確保敲低效率在60%以上。
贈送驗證抗體：如果用來進行WB驗證的抗體已經(jīng)在恩璣生命官網(wǎng)上架，則該抗體同樣可以免費提供20 μL供客戶使用。
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交付內(nèi)容：
① 構(gòu)建好的細胞株一瓶或者2支凍存株（包含空載對照）
② 電子版構(gòu)建報告（包括PCR驗證及WB全膜驗證）
③ 20 μL驗證使用的WB抗體（僅限恩璣官網(wǎng)上線的單克隆抗體）
注：非編碼基因不包含WB驗證和抗體
限于篇幅，更多產(chǎn)品詳見官網(wǎng)：https://www.enkilife.cn