肺炎克雷伯氏菌（KPn）核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）
[產(chǎn)品名稱]
商品名稱：肺炎克雷伯氏菌（KPn）核酸檢測試劑盒（熒光?PCR 法）
Name ：Diagnostic?Kit for Klebsiella Pneumoniae （Real-Time?PCR Method）
[包裝規(guī)格]25T/盒、50T/盒
[預(yù)期用途]
本試劑盒適用于檢測人或?qū)嶒?yàn)動物回盲部內(nèi)容物或病灶組織、臨床咽拭子、鼻咽分泌物、痰液樣本及食物樣本，用于肺炎克雷氏伯菌感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。
[檢驗(yàn)原理]
本試劑盒用一對肺炎克雷氏伯菌的特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光對?PCR 技術(shù)對肺炎克雷氏伯菌的?DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。
[試劑組成]
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
[儲存條件及有效期]
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸反復(fù)凍融次數(shù)不超過?5 次，有效期?12 個月。
[適用儀器]
ABI7500、安捷倫?MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量?PCR 檢測儀。
[標(biāo)本采集]
無菌采集患者的病灶組織、鼻汁、痰液、咽拭子、呼吸道粘膜等；疑似污染的食物取?1g。
[保存和運(yùn)輸]
采集或處理好的樣品在?2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過?24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過?3 次。
[使用方法]
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
固體樣本：手術(shù)剪剪碎混勻后取?0.5g 于研磨器中研磨，加入?1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至?1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm?離心?2min，取上清液?100μL 于?1.5mL 滅菌離心管中；液體樣本：直接取100μL?于?1.5mL 滅菌離心管中。
1.2 核酸提取
推薦采用核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，
請按照試劑說明書進(jìn)行操作。
試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的?反應(yīng)管管數(shù)為?（?樣本數(shù)?管陰性對照?管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿?10 份，多配制?1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到?PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟?1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取?5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量?PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為?25μL；
熒光通道選擇：?檢測通道（Reporter?Dye）FAM，?淬滅通道（Quencher?Dye）NONE，ABI?系列儀器請勿選擇?ROX 參比熒光，選擇?None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析?ABI7500 儀器為例）
反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)?Baseline 的?Start 值、End?值以及?Threshold 值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start?值可設(shè)在?3～15、End?值可設(shè)在?5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊?Analyze 自動獲得分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道?Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；
陰性：樣本檢測結(jié)果無?Ct 值，且無特異性擴(kuò)增曲線；
可疑：樣本檢測結(jié)果?35＜Ct?值≤40，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為?35值≤40，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性。
6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無?值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且?Ct 值≤32；
以上條件應(yīng)同時滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效
7. 檢測方法的局限性
1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果
4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
[注意事項(xiàng)]
1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7.實(shí)驗(yàn)完畢后用?次氯酸或?酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。