紅霉素-N-脫甲基酶（Erythromycin N-demethylase，ERND）試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質代謝中，尤其是藥物和毒物的代謝，具有重要作用。ERND在P450酶系中相當于CYP2B亞型，與藥物代謝的去甲基化密切相關。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產物而具有解毒作用，也可使某些藥物經CYP2B代謝活化。
紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)比色法測試盒
測定原理：
ERND催化紅霉素釋放甲醛，通過Nash比色測定甲醛含量，即可計算出ERND活性。
自備儀器和用品：
可見分光光度計、普通離心機，超速離心機、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水和冰。
紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)比色法測試盒
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水9 mL充分溶解。
試劑六：液體×1瓶，4℃保存。
試劑七：液體×1瓶，4℃保存。
標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管，加入10μl標準液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉入超速離心管中。
2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。
紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)比色法測試盒
測定操作：
1. 分光光度計預熱30 min以上，調節(jié)波長到412 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30 min。
3. 對照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃
水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。
4. 測定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。
5. 標準管：取1支EP管，加入500μL標準品，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。
注意：每個樣品都需要做對照管。
ERND活性計算公式：
(1) 按照蛋白濃度計算:
活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。
(2). 按照樣本質量計算:
活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T
= 45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W
C標準品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標準品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；W：樣本質量，g；T：催化反應時間，30min。
紅霉素-N-脫甲基酶(ERND)比色法測試盒
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