中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
注 意： 正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒測定意義：
NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無毒、水解能力強、作用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品、飼料、化妝品和營養(yǎng)保健品生產(chǎn)。
測定原理：
中性條件下，NP催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；在680nm有特征吸收峰。
自備儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體90mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加10 mL蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入20 mL試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱15-30分鐘，該試劑為過飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。
試劑四：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。
試劑五：液體10mL×1瓶，4℃保存。
標準品：液體1mL×1支，0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液，4℃保存。
中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒粗酶液提取：
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。
血清或培養(yǎng)液：直接測定。
細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒測定操作：
1.分光光度計預熱30min，調(diào)節(jié)波長到680 nm，蒸餾水調(diào)零。
2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min。
3. 對照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A對照管。
4. 測定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL
試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）
5. 空白管：取EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A空白管。
6. 標準管：取EP管，加入200μL標準品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A標準管。
注意：空白管和標準管只需要測定一次。
計算公式：
1. 按照樣本蛋白濃度計算
NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
NP活性（nmol/min /mg prot）= C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷Cpr
2．按照樣本質(zhì)量計算
NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1 nmol酪氨酸為1個酶活單位。
NP活性（nmol/min /g鮮重）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷W
3. 按照液體體積計算
NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
NP活性（nmol/min/mL）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷V1÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）
按照細胞數(shù)量計算
NP活性單位定義：30℃每104個細胞每分鐘催化水解產(chǎn)生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。
NP活性（nmol/min /104 cell）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×V反總÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷細胞數(shù)量
C標準品：0.25 μ mol/mL標準酪氨酸溶液；V反總：酶促反應總體積，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），0.1 mL；V2：提取液總體積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min；W：樣品質(zhì)量（g）。
注意事項：
臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3天內(nèi)使用完畢。
關(guān)鍵字： 中性蛋白酶（Neutral protea;中性蛋白酶（Neutral protea;
上海雅吉生物科技有限公司成立于2011年3月，是一家面向生命科學領(lǐng)域，提供科研類試劑、耗材、儀器、技術(shù)服務(wù)的生物企業(yè)。包括分子生物學、免疫學、微生物學、細胞學等 。旗下?lián)碛?“雅吉生物”、“晶風生物”、“彩佑實業(yè)”、“GTX” 品牌。通過公司各部門員工的共同努力在行業(yè)內(nèi)擁有較高知名度，深得新老客戶厚愛，本著“優(yōu)質(zhì)、服務(wù)、信譽”的精神，堅持以優(yōu)良的技術(shù)、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、良好的信譽為國內(nèi)外廣大用戶提供優(yōu)質(zhì)生物產(chǎn)品和服務(wù)。
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