NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50管/48樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋(píng)果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋(píng)果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴(lài)的MDH和NADP-依賴(lài)的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。
NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒測(cè)定原理：
NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋(píng)果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑二、液體50 mL×1瓶，在4℃保存；
試劑三、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四、粉劑×2支，-20℃保存；臨用前加入300μL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH）試劑盒測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑二在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。
3、 操作表：
試劑名稱(chēng)（μL） | 測(cè)定孔 |
樣本 | 20 |
試劑二 | 760 |
試劑三 | 10 |
試劑四 | 10 |
將上述試劑按順序加入1 mL石英比色皿中，混勻后立即在340 nm波長(zhǎng)下記錄初始吸光度A1和反應(yīng)1min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意：若A1-A2大于0.5，需將樣本用提取液稀釋?zhuān)?/span>A1-A2小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
NADP-MDH活力單位的計(jì)算：
1、血清（漿）NADP-MDH活力的計(jì)算
單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=6430×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中NADP-MDH活力的計(jì)算:
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V樣÷V樣總）÷T =6430×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。
NADP-MDH（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，8×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。
關(guān)鍵字： NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH;NADP-蘋(píng)果酸脫氫酶（NADP-MDH;
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