NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒說明書
分光光度法 50管/48樣
注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒測(cè)定意義：
NADPase主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)唯一催化NADP+降解為NAD+的酶，與NADK一起調(diào)控NAD和NADP之間的平衡。
測(cè)定原理：
NADPase能夠催化NADP+水解為NAD+和無機(jī)磷的反應(yīng)，通過測(cè)定無機(jī)磷的量來測(cè)定NADPase活性。
所需的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體30 mL×1瓶， 4℃保存。
試劑二：粉劑×5支，-20℃保存；用時(shí)每支加入1 mL試劑一充分溶解備用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑四：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時(shí)加入25mL蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑五：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑六：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑六20倍稀釋，即取 0.5mL試劑六加9.5蒸餾水，充分混勻。
定磷試劑的配制：按H2O: 試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑
應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注 意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
樣本的前處理：
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
NADP磷酸酶（NADPase）試劑盒操作步驟：
1、酶促反應(yīng)
試劑名稱（μL） | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
試劑一 | 300 | 300 |
試劑二 | 100 | 100 |
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱5min
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清
2、定磷
| 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 | 100 |
|
|
|
蒸餾水 |
| 100 |
|
|
上清液 |
|
| 100 | 100 |
定磷試劑 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值。
注意事項(xiàng)：
1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒有一點(diǎn)磷，若試管放過磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來水沖，最后用蒸餾水沖干凈。用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管和對(duì)照管只要做一次即可。
NADPase酶活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷
(V樣×Cpr)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每g組織NADPase分解NADP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè) NADPase活力單位。
NADPase (μmol/h/g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）×
V總÷(W× V樣÷V樣總)÷T=5×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5小時(shí)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。
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