中文名：miRNA小量制備試劑盒

英文名：miRNA miniprep Kit

貨號：M598102-50T

產(chǎn)品介紹：

本試劑盒用于從各種動物組織、植物組織和細(xì)胞中提取miRNA。提取的miRNA 分子完整、純度高，適用于Northern Blot 、Real-TimePCR、miRNA微列陣芯片、原位雜交、RNase保護(hù)測定等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

組分：

應(yīng)用范圍：

核酸提取及純化

使用方法：
一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1.所有試劑用DEPC處理過的溶劑配制。請選用RNase-free槍頭和離心管，以避免提取過程中RNA被RNase降解。
2.70%乙醇,- 20C預(yù)冷。
二、操作步驟：
不同的樣品提取miRNA的操作中略有區(qū)別，具體步驟分述如下：
【從動物組織中提取miRNA】
1.取20-40 mg組織，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨成粉末。
請按下面說明使用組織的量：
①RNA豐富的組織(如肝臟)：不超過30 mg
②RNA含量低的組織(如肌肉)：不超過100 mg
③當(dāng)使用的組織量小于20 mg時(shí)：R-I，R- II和異丙醇的使用量都減半
④當(dāng)使用的組織量大于40 mg時(shí)：R-I，R-II和異丙醇的使用量按比例增加
2.加入400 ul Buffer R- I，用裝有21-25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5 m|離心管(試劑盒內(nèi)提供)中。
3.加入150 μl BufferR-1l,漩渦振蕩15-30 s，12,000X g離心5 min。【建議在4℃下離心】
4.取上清至1.5 ml離心管中，加入180 u無水乙醇，混和均勻。
5.將制備管置于2 m|離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，轉(zhuǎn)移步驟4中的混合液到制備管中，12,000X g離心1 min?！劲俳ㄗh在4℃下離心；②miRNA在濾液中，注意保存濾液。】
6.棄制備管，在濾液中加入500 μl異丙醇，混和均勻。
7.12,000X g離心10 min,棄上清。
8.加入700 μl 70%乙醇( - 20℃預(yù)冷)，12,000Xg離心5min.
9.棄上清,室溫干燥5- 10 min。
10.離心管中加入70 ul Buffer TE (nucdease-free) 或RNase-free水洗脫miRNA。
【從植物組織中提取miRNA】
1.取30-150 mg組織，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的研缽中，加液氮研磨成粉末。
請按下面說明使用組織的量：
①植物葉子：通常用量10-80 mg
②植物纖維組織：通常用量100-150 mg
③當(dāng)植物葉組織量小于30 mg時(shí)：R-I，R-II和異丙醉的使用量都減半
④當(dāng)植物葉組織量大于80 mg時(shí)：R-I，R-II 和異丙醇的使用量按比例增加
⑤當(dāng)植物纖維組織量大于150 mg時(shí)：R-I，R- II和異丙醇的使用量按比例增加
2.加入400 ul BufferR- I，用裝有21-25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5 mI離心管( 試劑盒內(nèi)提供)中。.
3.加入150 ul Buffer R-1I,漩渦振蕩15-30 s, 12.000x g離心5 min。【 建議在4℃下離心】
4.取上清至1.5 ml離心管中，加入180 山無水乙醇，混和均勻。
5.將制備管置于2 mI離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，轉(zhuǎn)移步驟4中的混合液到制備管中，12.000xg離心1 min.【①建議在4℃下離心；②miRNA在濾液中，注意保存濾液。】
6.棄制備管，在濾液中加入500 μl異丙醇，混和均勻。
7. 12,000xg高心10 min,棄上清。
8.加入700 ul 70%乙醇( - 20℃預(yù)冷)，12,000xg離心5min.
9.棄上清,室溫干燥5 -10 min,
10.離心管中加入70 μl Buffer TE (nuclease-free) 或RNase-free水洗脫MiRNA。

【從細(xì)胞中提取miRNA】
步驟1-3根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的方式不同可以選擇a或b兩種實(shí)驗(yàn)方法
a.懸浮培養(yǎng)的動物細(xì)胞或從培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶中獲得的細(xì)胞懸浮液或新鮮分離的動物組織單細(xì)胞懸浮液:
1a.收集2X 10*-1X 10’的細(xì)胞，2,000Xg離心5 min，棄上清；
2a.加入400 μl BufferR- I，用裝有21-25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5mI離心管(試劑盒內(nèi)提供)中；
3a. 加入150 μl Buffer R1I，旋渦振蕩15-30s，12.000X g離心5 min.【建設(shè)在4℃下離心】。
b. 96-孔L, 24-孔,12-孔或6-孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞:
1b.從96-孔， 24-孔，12-孔或6-孔培 養(yǎng)板里收集細(xì)胞，盡量棄去培養(yǎng)基，每孔加入400 u山l Buffer R-I，用移液槍上下吹打8-10次；
2b.轉(zhuǎn)移上述細(xì)胞懸浮液到1.5 ml離心管( 試劑盒內(nèi)提供)中，用裝有21-25號針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次；
3b. 加入150 μl Bufflr R-II， 漩渦振蕩15-30 s， 12,000X g離心5 min.【建議在4℃下離心】
4.取上清至1.5 ml離心管中，加入180 山無水乙醇，混和均勻。
5.將制備管置于2 ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，轉(zhuǎn)移步驟4中的混合液到制備管中，12.000Xg離心1 min?！劲俳ㄗh在4℃下離心；②miRNA在濾液中，注意保存濾液。】
6.棄制備管，在濾液中加入500 u異丙醇，混和均勻。
7.12,000Xg高心10 min,棄上清。
8.加入700 μ 70%乙醇( - 20℃預(yù)冷)，12,000xg離心5min.
9.棄上清,室溫干燥5 -10 min.
10.離心管中加入70 ul Bufer TE (nucdease-free )或RNase-free水洗脫mRNA。
三、流程圖

注意事項(xiàng)：

Buffer R- I含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。

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