苯胺-4-羥化酶（AH）活性測定試劑盒說明書
微量法 100管/48樣
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
測定原理：
AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚，進一步轉變?yōu)榉?吲哚復合物，在630nm處有特征吸收峰；通過測定630nm吸光度增加速率，來計算AH活性。
組成：
產(chǎn)品名稱 | CP006-100T/48S | Storage |
試劑一：粉劑 | 1瓶 | 4℃ |
試劑二：液體 | 1瓶 | 4℃ |
試劑三：粉劑 | 1瓶 | 4℃ |
試劑四：粉劑 | 1瓶 | 4℃ |
試劑五：液體 | 1瓶 | 4℃ |
試劑六：粉劑 | 1瓶 | 4℃避光 |
試劑七：粉劑 | 1瓶 | 4℃ |
標準液：液體 | 1瓶 | 4℃避光 |
說明書 | 一份 |
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入100ml蒸餾水，充分溶解。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10ml蒸餾水，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5ml蒸餾水，充分溶解。
試劑六：粉劑×1瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入10ml蒸餾水，充分溶解。
試劑七：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10ml蒸餾水充分溶解。
標準液：液體×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
自備儀器和用品：
普通離心機、超速離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、雙蒸水和冰。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1ml試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心30min，取上清液，轉移到超速離心管中。
2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1ml試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5ml，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節(jié)波長到630 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預熱30min。
3. 試劑五置于冰浴預冷30min。
4. 標準管：取0.5 ml EP管，加入100μl標準液，100μl試劑六，100μl試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測定光吸收，記為A標準管。
5. 對照管：取0.5 ml EP管，加入50μl粗酶液，100μl試劑三，50μl蒸餾水，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入100μl試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取100μl上清液，加入新的0.5 ml EP管；再加入100μl試劑六，100μl試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測定光吸收，記為A對照管。
6. 測定管：取0.5 ml EP管，加入50μl粗酶液，100μl試劑三，50μl試劑四，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入100μl試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取100μl上清液，加入新的0.5 ml EP管；再加入100μl試劑六，100μl試劑七，混勻后室溫靜置30min，吸取200μl于微量玻璃比色皿/96孔板，630 nm測定光吸收，記為A測定管。
AH活性計算公式：
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W
C標準品：10μmol/L；V標準品：100μl=1×10-4L；稀釋倍數(shù)： V反總÷V上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應時間（min），30min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr
（2）按樣本質量計算
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數(shù)÷(W×V樣)÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W
C標準品：10μmol/L；V標準品：100μl=1×10-4L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=300μl÷100μl=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/ml），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒； W ：樣品質量； V樣：加入反應體系中粗酶液體積， 50μl=0.05 ml； T：催化反應時間（min），30min。
關鍵字： 苯胺-4-羥化酶（AH）檢測試劑盒（微量;
伊勢久（江蘇連云港）生物科技有限責任公司，成立于2019年，坐落于新亞歐大陸橋東方橋頭堡連云港市。公司由資深行業(yè)專家和雙一流高校博士聯(lián)合創(chuàng)辦，主要從事生化檢測、病理檢測和原料酶等相關試劑的研發(fā)和生產(chǎn)。
我司位于聯(lián)東U谷科技創(chuàng)新谷內的2000平米的生產(chǎn)、研發(fā)基地已建成投入運行，其中包括150平米的超十萬級的潔凈車間。我司堅持以自主研發(fā)為核心，現(xiàn)已生產(chǎn)出的脲酶、tRNA轉運核糖核酸、刀豆球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等產(chǎn)品，熱銷市場以來收到了客戶的廣泛好評。
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