SIGMA P215-1MG  PD 98059; P215-5MG

五洲元業(yè)特別提醒：注意該試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，否則會(huì)有結(jié)晶析出。

采用Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液分離成人MSC ,體外擴(kuò)增 ,應(yīng)用地塞米松、β -甘油磷酸鈉、vitaminC定向誘導(dǎo)MSC分化為成骨細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)液中加入不同劑量的PD980 59,觀察其對(duì)成骨細(xì)胞形成的影響。結(jié)果 :MSC體外擴(kuò)增 1 5代可獲得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 個(gè)細(xì)胞。

目的 :探討胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 (ERK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)分化為成骨細(xì)胞的影響。方法 :采用Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液分離成人MSC ,體外擴(kuò)增 ,應(yīng)用地塞米松、β -甘油磷酸鈉、vitaminC定向誘導(dǎo)MSC分化為成骨細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)液中加入不同劑量的PD980 59,觀察其對(duì)成骨細(xì)胞形成的影響。結(jié)果 :MSC體外擴(kuò)增 1 5代可獲得 (3 - 4 )× 1 0 1 2 個(gè)細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)液作用下 ,MSC可在體外定向分化為成骨細(xì)胞。不同劑量的PD980 59均可抑制MSC分化為成骨細(xì)胞 ,并有劑量依賴關(guān)系 ;同時(shí)促使部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞。結(jié)論 :ERK信

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)級(jí)聯(lián)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中的重要一員，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切[1]。乙型肝炎病毒(HBV)x(HBx)基因是一種致肝癌的重要因子，能激活肝細(xì)胞內(nèi)ERK通路，從而影響細(xì)胞生物學(xué)特性[2，3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞(HBx+ HepG2)對(duì)順鉑以及順鉑聯(lián)合MAPK/ERK激酶(MEK)特異性抑制劑PD98059敏感性差異的研究，探討PD98059提高HBx+HepG2對(duì)順鉑敏感性的作用機(jī)制。
一、材料與方法
1. 質(zhì)粒、細(xì)菌及細(xì)胞株：質(zhì)粒pCP10由北京解放軍第三0二醫(yī)院傳染病研究所成軍教授惠贈(zèng)，內(nèi)含兩拷貝的HBV ayw亞型全長(zhǎng)基因組序列；pcDNA3真核表達(dá)載體購(gòu)于美國(guó)Stratagene公司；感受態(tài)菌株由鄭州大學(xué)消化疾病研究所自制；人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；宿主菌E.coli JM109由鄭州大學(xué)消化疾病研究所保存。
2. 主要試劑：質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠純化試劑盒為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購(gòu)自大連寶生物公司；轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine plus為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；超純質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自武漢Vata-gene公司；RNA抽提試劑盒為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品；鼠抗人單克隆抗體p-ERK1/2、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司；PD98059為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。引物合成和DNA測(cè)序分別由上海生工生物工程公司、北京賽百勝生物技術(shù)公司完成。
3. 引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用Oligo引物設(shè)計(jì)軟件，以HBx基因的開(kāi)放讀碼框(ORF)為目的片段設(shè)計(jì)巢式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，于內(nèi)引物5′端分別加入EcoRⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，其引物序列上游：5′-CGGAAGCTTATGGCTGCT AGGCTGTGCTG-3′，下游：5′-CGGAATTCTTAGGCA GAGGTGAAAAAGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度482bp；外引物序列上游：5′-TGCGTTGATGCCTTTGTATG-3′，下游：5′-AGAATTGCTTGCCTGAGTGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度1034bp。
4. 載體的構(gòu)建和鑒定：將HBx的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3均進(jìn)行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，目的片段行凝膠回收，載體和靶片段(1:5)用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，小量制備表達(dá)載體pcDNA3-HBx。將重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段是否存在，并將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序。
5. 質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性細(xì)胞的篩選：轉(zhuǎn)染前1d于24孔板中接種約70%孔底面積的HepG2，24h后轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒組和脂質(zhì)體組。含G418培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，以500μg/ml的濃度篩選2周，待對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，將濃度降至200μg/ml維持篩選。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR，鑒定HBx-ORF是否存在。
6. Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表達(dá)情況：收集1×107個(gè)細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，4℃ 12000r/min離心5min，收集沉淀。加入預(yù)冷的裂解液30μl，吹打均勻，4℃ 10 000r/min離心2min，吸上清液準(zhǔn)備上樣或-80℃保存。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)印于聚偏氟乙烯膜上。封閉液室溫封閉1h；分別加入抗體(1:100)與第二抗體(1:1000)，37℃孵育1h；DAB顯色。
7. 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性：分別將陽(yáng)性組細(xì)胞、空質(zhì)粒組細(xì)胞、脂質(zhì)體組細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，以1×104/孔接種于96孔板，待其完全貼壁后，先用無(wú)血清、無(wú)抗菌素培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜使其同步化。然后每孔加入含2μg/ml順鉑的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。陽(yáng)性細(xì)胞另設(shè)一組，在加入順鉑前，先用含100μmol/L PD98059的培養(yǎng)基孵育2h，再加入相同濃度順鉑進(jìn)行孵育。每組均設(shè)正常對(duì)照及空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，按MTT法測(cè)530nm處吸光度值(A)。抑制率(IR)=(1－加藥孔A值/對(duì)照孔A值)×100%。
8. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。
二、結(jié)果
1. 表達(dá)載體的鑒定：對(duì)pcDNA3-HBx行雙酶切，得到含粘性末端的HBx-ORF片段，長(zhǎng)475bp(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段與質(zhì)粒中HBx-ORF基因100%同源。
2. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選：對(duì)轉(zhuǎn)染pcDNA3-HBx的HepG2經(jīng)G418篩選3～4周后分別挑選抗性克隆，RT-PCR檢測(cè)HBx-ORF mRNA。結(jié)果顯示陽(yáng)性細(xì)胞中存在目的片段，長(zhǎng)485bp(圖2)。
3. 各組細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)：HBx+細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)明顯強(qiáng)于空質(zhì)粒組細(xì)胞和脂質(zhì)體組細(xì)胞(ERK1為4.4×104，ERK2為4.2×104)，見(jiàn)圖3。
4. 各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性：順鉑對(duì)HBx+細(xì)胞抑制率明顯低于空質(zhì)粒組和脂質(zhì)體組(P<0.01)。而先用PD98059孵育的HBx+細(xì)胞，順鉑對(duì)其抑制率顯著上升(表1)。
表1  順鉑對(duì)各組細(xì)胞的抑制率(x-±s)
組別 樣本數(shù)  抑制率(%)
脂質(zhì)體組 9 32.51±2.49*
空載體組 9 30.18±3.24*
HBx+組 9 20.23±1.98
PD98059組 9 31.20±3.26*
　　與HBx+組相比，* P<0.01
三、討論
ERK1/2通過(guò)其上游的激酶MEK1/2，及其激酶的激酶Raf逐級(jí)磷酸化，最終激活自身的蘇氨酸、酪氨酸激酶而活化[4]。激活的ERK移位到細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，從而激活一些基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，其最終結(jié)果與腫瘤的惡性演變相關(guān)[5，6]。
X蛋白(pX)是HBV 4個(gè)ORF中X-ORF編碼的一種病毒蛋白，是誘發(fā)肝細(xì)胞癌的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)，能被pX激活的轉(zhuǎn)錄因子有核因子-κB、AP-1、AP-2和SP-1等，而pX是通過(guò)激活ERKs、JNKs、MAP和Ras-Raf-MAP等酶聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)來(lái)激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。癌基因和原癌基因被激活后，可激發(fā)相應(yīng)的致癌效應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)HBx可以激活細(xì)胞內(nèi)的ERK通路，從而降低HepG2對(duì)順鉑的敏感性。而以PD98059阻斷ERK的激活之后，HBx+ HepG2對(duì)順鉑的敏感性恢復(fù)至正常HepG2的水平。從而為確定一個(gè)肝癌輔助治療靶點(diǎn)，提高乙型肝炎后肝癌化學(xué)治療的效果提供理論基礎(chǔ)。