檢測(cè)目標(biāo)

靶基因：MBV的高度保守的p74基因（編碼包涵體基質(zhì)蛋白，毒力標(biāo)志）。

覆蓋毒株：亞洲主要流行株（如泰國(guó)株TH-2023、中國(guó)株CN-GD2025）。

檢測(cè)限：10拷貝/μL，較傳統(tǒng)病理學(xué)檢測(cè)（需電鏡觀察）靈敏度提升100倍。

方法原理

一步法熒光RT-PCR：

FAM標(biāo)記探針實(shí)時(shí)檢測(cè)p74基因，內(nèi)標(biāo)（HEX標(biāo)記對(duì)蝦β-actin基因）監(jiān)控提取質(zhì)量。

采用抗抑制劑聚合酶，適配高鹽/高有機(jī)物樣本（如肝胰腺組織）。

適用樣本

對(duì)蝦組織：肝胰腺（病毒富集部位）、鰓、幼體（PL階段）

環(huán)境樣本：養(yǎng)殖水體（需0.22μm濾膜濃縮）

二、試劑盒組分與操作流程

1. 核心組分

組分 功能說(shuō)明

RT-PCR預(yù)混液 含逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動(dòng)Taq酶、dNTPs（抗肝胰腺多糖干擾優(yōu)化）

探針引物混合液 p74-FAM探針 + β-actin-HEX內(nèi)標(biāo)引物

陽(yáng)性對(duì)照 滅活MBV泰國(guó)株RNA（NACA認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)品）

快速裂解液 含離液鹽和蛋白酶K，支持組織直接裂解（免提取，15分鐘完成前處理）

2. 操作步驟（以肝胰腺樣本為例）

樣本處理：

50mg組織勻漿 + 200μL裂解液，95℃加熱5分鐘滅活病毒。

PCR擴(kuò)增（25μL體系）：

50℃ 15min（RT）→ 95℃ 3min → [95℃ 10s → 60℃ 30s]×40 cycles

結(jié)果判讀：

p74（FAM）Ct≤35 → MBV陽(yáng)性；內(nèi)標(biāo)（HEX）Ct≤30 → 樣本質(zhì)量合格。

三、性能與質(zhì)控

1. 關(guān)鍵參數(shù)

指標(biāo) 性能標(biāo)準(zhǔn) 驗(yàn)證方法

靈敏度 100%檢出（≥102拷貝/mg組織） 梯度稀釋實(shí)驗(yàn)

特異性 不與WSSV、IHHNV交叉 30種常見(jiàn)水產(chǎn)病原驗(yàn)證

重復(fù)性 Ct值標(biāo)準(zhǔn)差≤0.5（n=10） 室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

2. 質(zhì)控要求

每批次檢測(cè)需包含：

陽(yáng)性對(duì)照（Ct值28±2）

陰性對(duì)照（對(duì)蝦健康組織）

無(wú)模板對(duì)照（NTC）

四、注意事項(xiàng)

采樣規(guī)范

瀕死對(duì)蝦肝胰腺檢出率最高，采樣后立即置于RNA保存液中（-80℃保存≤3個(gè)月）。

生物安全

MBV屬OIE須申報(bào)病原，實(shí)驗(yàn)廢棄物需121℃高壓滅菌30分鐘。

局限性

不能區(qū)分疫苗株（如減毒活疫苗）與野生毒株。

五、應(yīng)用場(chǎng)景

養(yǎng)殖場(chǎng)防控：

苗種檢疫（杜絕帶毒PL入池）。

發(fā)病期監(jiān)測(cè)（病毒載量＞10拷貝/mg時(shí)死亡率＞80%）。

進(jìn)出口貿(mào)易：

符合OIE《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》第2.2.8章檢測(cè)要求。

科研應(yīng)用：

病毒變異追蹤（p74基因突變與毒力關(guān)聯(lián)研究）。