核苷酸（ATP、ADP、AMP）含量測(cè)定試劑盒高效液相色譜法/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
核苷酸具有重要的生物學(xué)功能，是一類由嘌呤堿或嘧啶堿、核糖或脫氧核糖以及磷酸三種物質(zhì)組成的化合物，主要參與構(gòu)成核苷。

三磷酸腺苷（ATP）被認(rèn)為是一種在所有生物體生存和繁殖的細(xì)胞合成中必不可少的普遍能量來(lái)源。ATP 可通過(guò)多種細(xì)胞途徑產(chǎn)生。最典型的如在線粒體中通過(guò)氧化磷酸化由三磷酸腺苷合酶合成，或者在植物的葉綠體中通過(guò)光合作用合成。ATP 合成的主要能源為葡萄糖和脂肪酸。

二磷酸腺苷（ADP）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中。在生物體內(nèi)，通常為三磷酸腺苷（ATP）水解失去一個(gè)磷酸根，即斷裂一個(gè)高能磷酸鍵，并釋放能量后的產(chǎn)物。

一磷酸腺苷（AMP）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中， 是在機(jī)體內(nèi)由 ATP 與 ADP釋放能量之后形成的?？梢岳^續(xù)結(jié)合磷酸基團(tuán)形成二磷酸腺苷(ADP)和三磷酸腺苷(ATP)。是 ATP 不完全水解的產(chǎn)物。

ATP 、ADP 、AMP 在 254 nm 下有吸收峰，可以利用高效液相色譜法根據(jù)不同的出峰時(shí)間和峰面積來(lái)測(cè)定不同核苷酸含量。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

高效液相色譜儀（C18 柱（4.6×250 mm）、紫外檢測(cè)器（VWD））、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、棕色 EP 管、0.45 μm 水系針頭式過(guò)濾器（50 個(gè)）、注射器、抽濾器、有機(jī)系濾膜、水系濾膜、2 mL 棕色進(jìn)樣瓶（50 個(gè)）、色譜純乙腈（500 mL）、超純水。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液一：液體 80 mL ×1 瓶，2-8℃保存。

提取液二：液體40 mL ×1 瓶，2-8℃保存。

試劑一：液體 15 mL ×1 瓶，2-8℃保存。臨用前取 3.5 mL 試劑一加入到 1000 mL 超純水中，用試劑二調(diào)節(jié)其 pH = 6.15，形成流動(dòng)相 B，密封。

試劑二：液體 10 mL ×1 瓶，2-8℃保存。

ATP 標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支， -20℃保存。臨用前加入 1.8 mL 蒸餾水配制成 1 μmol/mL ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃凍存。為了保證 ATP 的完整性，請(qǐng)避免反復(fù)凍融。

ADP 標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，-20℃保存。臨用前加入 2.34 mL 蒸餾水配制成 1 μmol/mL ADP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃凍存。為了保證 ADP 的完整性，請(qǐng)避免反復(fù)凍融。

AMP 標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支， -20℃保存。臨用前加入 2.0 mL 蒸餾水配制成 1 μmol/mLAMP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃凍存。為了保證 AMP 的完整性，請(qǐng)避免反復(fù)凍融。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作：
1. 將 500 mL 色譜純乙腈（流動(dòng)相 A）和 1000 mL  配制好的流動(dòng)相 B 用濾膜抽濾，除去溶劑中雜質(zhì)，以防堵塞色譜柱。（乙腈采用 0.45 μm 有機(jī)系濾膜抽濾，配制好的流動(dòng)相 B 采用0.22 μm 水系濾膜抽濾）。

2. 將配制好的流動(dòng)相 A 、B 超聲 30 min，除去溶劑中的氣體，防止阻塞色譜柱，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3. ATP 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將 1 μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋成 0.5 μmol/mL、0.1μmol/mL、 0.05 μmol/mL 、0.01 μmol/mL 、0.005 μmol/mL 的 ATP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

4. ADP 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將 1 μmol/mL 的 ADP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋成 0.5 μmol/mL、0.1μmol/mL、 0.05 μmol/mL、0.01 μmol/mL 、0.005 μmol/mL 的 ADP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。（配制的標(biāo)準(zhǔn)品濃度僅供參考，可根據(jù)實(shí)際樣品濃度進(jìn)行調(diào)整）。

5. AMP 標(biāo)準(zhǔn)品的配制：將 1 μmol/mL 的AMP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋成0.5 μmol/mL、0.1μmol/mL、 0.05 μmol/mL 、0.01 μmol/mL 、0.005 μmol/mL 的 AMP 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。（配制的標(biāo)準(zhǔn)品濃度僅供參考，可根據(jù)實(shí)際樣品濃度進(jìn)行調(diào)整）。

6. 采用水系針頭式過(guò)濾器過(guò)濾到棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)待測(cè)（測(cè)試前請(qǐng)?zhí)崆胺胖贸貭顟B(tài)，以免對(duì)保留時(shí)間造成影響）。

操作步驟：
一、核苷酸的的提?。?/span>

1.  組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）1:5~10 的比例（建議稱取 0.3 g 組織樣本，加入 1.5 mL 提取液）加入提取液一，冰浴勻漿，然后冰浴浸提 40 min 。4℃條件下 10000 rpm離心 10 min，取上清液 750 μL，加入 750 μL 的提取液二，充分震蕩（5 min）混勻后，再次在 4℃條件下 10000 rpm 離心 10 min。取上清液，采用水系針頭式過(guò)濾器過(guò)濾到棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)置常溫待測(cè)(2 h 之內(nèi))。

2.  細(xì)胞樣本：按照 1000 萬(wàn)（個(gè)）：提取液一體積（mL）1000~500:1 的比例（建議取 1000 萬(wàn)細(xì)胞樣本，加入 1 mL 提取液一）加入提取液一，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300W，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3 min）；于 4℃, 10000 rpm 離心 10 min，取 0.75 mL 上清液，再加入 0.75 mL 提取液二，充分震蕩（5 min）混勻后，再次在 4℃條件下 10000 rpm 離心 10 min。取上清液，采用水系針頭式過(guò)濾器過(guò)濾到棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)置常溫待測(cè)(2 h 之內(nèi))。

3.  血清：建議稱取 0.4 mL 血清樣本，加入 0.6 mL 提取液一，冰浴浸提 40 min。4℃條件下 10000 rpm 離心 10 min，取上清液 0.75 mL，加入 0.75 mL 的提取液二，充分震蕩（5 min）混勻后，再次在 4℃條件下 10000 rpm 離心 10 min，取上清液，采用水系針頭式過(guò)濾器過(guò)濾到棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)置常溫待測(cè)(2 h 之內(nèi))。

注  意：

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。