產品描述
本試劑盒是為特異性檢測人GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) 基因mRNA表達水平而優(yōu)化的熒光定量PCR (qPCR) 檢測系統(tǒng)。采用SYBR Green I 染料法進行實時熒光檢測。試劑盒包含經過優(yōu)化的預混液、特異性引物、陽性對照及必要的輔助試劑。
產品名稱 | 人GAPDH基因染料法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Human GAPDH Gene Dye-based Quantitative Real-time PCR Kit |
產品規(guī)格 | 50T | 產品分類 | 熒光定量PCR |
檢測類型 | PCR檢測 | 產品貨號 | PR2703 |
核心優(yōu)勢
高特異性： 預先設計并驗證的高特異性人GAPDH引物對，有效擴增目標片段，減少引物二聚體和非特異擴增。
高靈敏度： 可檢測低至數(shù)個拷貝的靶標分子。
高擴增效率： 優(yōu)化的反應體系確保擴增效率接近100%，保證定量準確性。
寬動態(tài)范圍： 可跨越多個數(shù)量級進行準確定量 (>6 logs)。
操作簡便： 預混的Master Mix包含熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2?、SYBR Green I染料及穩(wěn)定劑，只需加入模板、引物和水即可配制反應體系。
穩(wěn)定可靠： 嚴格質控，確保批間穩(wěn)定性。
兼容性好： 適用于多種主流實時熒光定量PCR儀。
應用領域
基因表達分析（mRNA水平）中作為內參基因 (Housekeeping Gene)，用于目標基因相對定量的標準化。
細胞或組織樣本中人GAPDH表達水平的絕對或相對定量。
RNA樣本質量評估。
實驗操作流程
1. 實驗前準備
將所有試劑（除預混液外）置于冰上融化，完全溶解后短暫離心使液體沉至管底。
Master Mix (含染料) 需避光保存，融化后請置于冰上或冷暗處。 輕彈或渦旋混勻，避免劇烈振蕩產生氣泡，短暫離心。
設計好實驗布局（標準曲線孔、待測樣品孔、陽性對照孔、陰性對照孔），記錄孔位。
準備好工作液（可選）：將10μM的GAPDH Forward和Reverse Primer等體積混合，配制成5μM的Primer Mix工作液。
2. 反應體系配制 (以單管20μL體系為例)
推薦反應體系：
| 組分 | 體積 (μL) | 終濃度/含量 |
| 2x SYBR Green qPCR Master Mix | 10 | 1x |
| GAPDH Forward Primer (10μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| GAPDH Reverse Primer (10μM) | 0.4 | 0.2 μM |
| Nuclease-Free Water | Variable | - |
| 模板 (cDNA) | 2-4 | (建議體積) |
| 總體積 | 20 | |
模板體積： 通常加入2-4 μL cDNA作為模板。具體加入量需根據(jù)cDNA濃度和PCR儀器靈敏度優(yōu)化。建議進行預實驗確定最佳模板量（避免Ct值過小<15或過大>30）。標準曲線模板需稀釋。
Water體積： 通過添加Nuclease-Free Water將終體積補足至20 μL。例如，加2μL模板時需加7.2μL水（10 + 0.4 + 0.4 + 7.2 + 2 = 20）。
引物添加： 使用Primer Mix工作液時，加入0.8 μL (5μM) 即可代替0.4μL F和0.4μL R。
配制方法：
在冰上或冷板上，按計算好的體積依次向反應管/孔中加入Nuclease-Free Water、Master Mix、引物。
輕柔混勻（可用移液器吹打或輕彈），避免產生氣泡。
最后加入模板cDNA (換新吸頭)，再次輕柔混勻（或用移液器吸打幾次）。
短暫離心，使液體集中于管底/孔底。
若使用96孔板，需蓋好光學蓋膜或封板膜。
對照設置：
陽性對照 (Positive Control)： 用陽性對照DNA代替模板cDNA（通常用1-2μL的1000拷貝/μL原液或適當稀釋液）。用于驗證試劑盒和反應體系是否正常工作。
無模板對照 (No Template Control, NTC)： 用等體積的Nuclease-Free Water代替模板cDNA。用于檢測體系是否存在污染或引物二聚體。
標準曲線 (Standard Curve, 可選)： 如需進行絕對定量，需用陽性對照DNA進行系列稀釋（如10^6, 10^5, 10^4, 10^3, 10^2拷貝/μL），每個稀釋度做3個復孔。用于建立拷貝數(shù)與Ct值的關系。
3. PCR擴增程序
將反應管/板放入實時熒光定量PCR儀中。
設置以下推薦程序（具體參數(shù)可能需要根據(jù)儀器型號和Master Mix特性微調）：
| 步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) | 采集熒光信號 |
| 1. 預變性 | 95℃ | 5 min | 1 | 否 |
| 2. 循環(huán)擴增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 否 |
| | 60℃ | 30 sec | | 是 (SYBR通道) |
| 3. 熔解曲線 | 95℃ | 15 sec | 1 | 否 |
| | 60℃ | 1 min | | 否 |
| | 95℃ | 15 sec | | 是 (連續(xù)采集) |
| | 60℃ | 15 sec | | 否 |
預期結果
擴增曲線： 陽性對照和樣品孔應呈現(xiàn)典型的S型擴增曲線，指數(shù)期明顯。
Ct值： 在cDNA質量良好且模板量適中的情況下，GAPDH的Ct值通常在 15-25個循環(huán) 之間（具體取決于樣本類型、RNA量、cDNA投入量）。不同樣本間Ct值應相對穩(wěn)定（變異?。@是其作為良好內參基因的標志。陽性對照Ct值應與其稀釋倍數(shù)對應。NTC Ct值應 >35 或無Ct值。
熔解曲線： GAPDH擴增產物應呈現(xiàn)單一的、尖銳的熔解峰。Tm值應一致。
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關鍵字： 人GAPDH基因;染料法熒光定量;PCR試劑盒;
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