6-磷酸葡萄糖(G6P)含量試劑盒(酶法)
一、產品簡介：
6-磷酸葡萄糖(G6P)含量試劑盒(酶法)
在酶作用下分解，被特異性酶氧化產生與顯色劑反應的（粉）紅色產物，該產物在510nm處有最大吸收峰，通過校正游離的背景值進而得到含量值。
二、試劑盒組分與配制：
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存要求 | 備注 |
提取液A1 | 粉體mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加3mL的蒸餾水充分溶解備用。 |
提取液A2 | 粉體mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加3mL的蒸餾水充分溶解備用。 |
試劑一 | 液體μL×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使微量液體落入底部，再加0.6mL蒸餾水混勻。 |
試劑二 | 液體3mL×1瓶 | 4℃保存 |
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試劑三 | 液體8mL×1瓶 | 4℃保存 |
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試劑四 | 液體14mL×1瓶 | 4℃保存 | 臨用前加7mL試劑三混勻備用 |
試劑五 | 粉體mg×1支 | -20℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使粉體落入底部，再加1.1mL蒸餾水溶解備用。 |
標準品 | 粉體mg×1支 | 4℃保存 | 臨用前甩幾下或離心，使粉體落入 底部，再加2mL蒸餾水溶解即5mg/mL的葡萄糖，再稀釋10倍成0.5mg/mL備用測定。 |
三、所需儀器和用品：
酶標儀、96孔板、天平、移液器、研缽、離心機、蒸餾水。
四、含量檢測：
建議正式實驗前選取2個樣本做預測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！
1、樣本制備：
① 組織樣本：0.1g組織樣本（水分充足的樣本建議取0.2g左右），加1mL的蒸餾水研磨，粗提液全部轉移到EP管中，12000rpm，常溫離心10min，上清液待測。
② 液體樣品：近似中性的澄清液體樣本可直接檢測；若為酸性樣本則需先用NaOH(2M)調PH值約7.4，然后室溫靜置30min，取澄清液體直接檢測。
③ 高蛋白含量組織樣本：稱取約0.1g樣本（水分充足的樣本建議取0.2g左右），加0.9mL的蒸餾水研磨，粗提液全部轉移到EP管中，加入0.05mL提取液A1，混勻后加入0.05mL提取液A2，混勻，用蒸餾水定容到1mL，室溫靜置30min，若有脂肪除去上層脂肪，12000rpm室溫離心10min，取澄清的液體檢測。
④ 細胞樣本：先收集細胞到離心管內，離心后棄上清；取約500萬細胞加入1mL生理鹽水或磷酸緩沖液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；12000rpm 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
【注】：若增加樣本量，可按照細菌/細胞數量（104）：提取液（mL）為500~1000：1的比例進行提取。
2、上機檢測：
① 酶標儀預熱30min，設置溫度在25℃，設定波長到510nm。
② 所有試劑解凍至室溫（25℃）。
③ 做實驗前可以選取幾個樣本做預測定，若待檢測指標含量較高可通過用蒸餾水稀釋找出適合本次檢測樣本的稀釋倍數D。
④ 在96孔板中依次加入：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 （僅做一次） | 空白管 （僅做一次） |
樣本 | 10 | 10 |
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標準品 |
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| 10 |
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蒸餾水 | 20 | 30 | 30 | 40 |
試劑一 | 10 |
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試劑二 | 30 | 30 | 30 | 30 |
混勻，25℃條件下孵育20min |
試劑四 | 170 | 170 | 170 | 170 |
試劑五 | 10 | 10 | 10 | 10 |
混勻，37℃條件下避光孵育30min，510nm下讀取吸光值A， △A=A測定-A對照（每個樣本做一個自身對照）。 |
【注】1.若對照管的A值超過0.6，樣本需用蒸餾水進行稀釋，稀釋倍數D代入計算公式。
2.若△A的值低于0.01，可增加樣本加樣體積V1（如增至20μL，則蒸餾水相應減少），改變后的V1代入計算公式重新計算。
五、結果計算：
1、按照質量計算：
含量(mg/g鮮重)=(C標準×V1)×△A÷(A標準-A空白) ×342.3÷180.16÷(W×V1÷V) ×D
=0.95×△A÷(A標準-A空白)÷W×D
2、體積計算：
含量(mg/mL)=(C標準×V1)×△A÷(A標準-A空白) ×342.3÷180.16÷V1×D
=0.95×△A÷(A標準-A空白)×D
3、按細胞數量計算：
含量(mg/104 cell)=(C標準×V1)×△A÷(A標準-A空白)×342.3÷180.16÷(細胞數量
×V1÷V)×D=0.95×△A÷(A標準-A空白) ÷細胞數量×D
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