斑點病密螺旋體染料法熒光定量PCR試劑盒

商品屬性

產品用途

本試劑盒采用 SYBR Green I 熒光染料法，通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術，定性檢測兔組織、生殖器拭子、皮損滲出液等樣本中的 斑點病密螺旋體（Treponema paraluiscuniculi）特異性DNA。適用于兔螺旋體?。ㄍ妹范荆┑膶嶒炇以\斷、流行病學調查及病原監(jiān)控。

檢測原理

核酸提?。簶颖局?/span>DNA經柱式或磁珠法提取純化。

qPCR擴增：

使用特異性引物擴增 T. paraluiscuniculi 保守基因片段（如 tpp47 基因或16S rRNA基因）。

SYBR Green I 染料嵌入雙鏈DNA中，在激發(fā)光下釋放熒光信號，熒光強度與產物量成正比。

結果判定：根據(jù)擴增曲線、熔解曲線（Tm值）及Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）判斷樣本中是否含目標病原。

試劑盒組分（48 Tests）

| 組分名稱 | 體積/數(shù)量 | 儲存條件 |

| qPCR Premix (2×) | 1.25 mL × 2 管 | -20℃避光 |

| T. paraluiscuniculi 引物混合液 | 150 μL × 1 管 | -20℃ |

| 陽性對照（基因組DNA） | 50 μL × 1 管 | -20℃ |

| 陰性對照（無核酸水） | 1 mL × 1 管 | -20℃ |

| RNase-Free Water | 1 mL × 1 管 | 室溫 |

適用儀器

所有主流熒光定量PCR儀：

Bio-Rad CFX系列、Applied Biosystems QuantStudio系列、Roche LightCycler? 480、Thermo Fisher StepOnePlus?等。

樣本要求

| 樣本類型 | 采集/保存方法 | 建議用量 |

| 生殖器/皮損拭子 | 無菌棉簽采集，置于1 mL PBS或生理鹽水中 | 200 μL |

| 組織（皮膚、淋巴結等） | 無菌采集，-80℃或RNAlater保存 | 20–30 mg |

| 全血/血清 | EDTA抗凝管采集，-20℃保存 | 200 μL |

注意：避免樣本反復凍融，提取前需充分勻漿/離心。

檢測流程

DNA提?。ㄍ扑]試劑盒）：

使用商業(yè)DNA提取試劑盒（如QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit）。

洗脫體積：50–100 μL。

qPCR反應體系配制（20 μL/反應）：

| 組分                | 體積    |  

| 2× qPCR Premix      | 10 μL  |  

| 引物混合液          | 0.8 μL  |  

| 模板DNA             | 2–5 μL  |  

| RNase-Free Water    | 補至20 μL |  

qPCR程序設置：

階段     溫度       時間        循環(huán)數(shù)  

預變性   95℃       5 min       1  

擴增     95℃       10 sec      40  

         60℃       30 sec  

         72℃       15 sec（采集SYBR熒光）  

熔解曲線  65℃→95℃  每0.5℃升溫5 sec |  

結果判讀

陽性：

Ct值 ≤ 35.0，且熔解曲線Tm值符合預期（例如：85.0±1.5℃）。

可疑：

Ct值 35.1–38.0，需重復檢測確認。

陰性：

無擴增曲線（Ct值 Undetected）。

質控要求：

陽性對照：Ct ≤ 30.0

陰性對照：無擴增信號

性能指標

| 參數(shù) | 性能 |

| 檢測限（LoD） | 10 拷貝/反應 |

| 特異性 | 不擴增兔其他病原及共生微生物 |

| 重復性 | CV ≤ 5% (Ct值) |

| 線性范圍 | 102–10? 拷貝/μL (R2>0.99) |

注意事項

儲存：-20℃避光保存，避免反復凍融（≤3次）。

污染控制：PCR分區(qū)操作（樣本處理區(qū)、配制區(qū)、擴增區(qū)），使用紫外燈及酶清潔劑。

生物安全：陽性對照含失活DNA，仍須按II類病原體處理廢棄物。

驗證：首次使用前建議用標準品驗證擴增效率（90–110%）。

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