Ca++Mg++ ——ATP酶測試盒
測定意義與原理
測定意義
Ca2?-Mg2?-ATP酶是存在于組織細胞及細胞器膜上的一種蛋白酶，可催化質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的ATP水解，釋放能量驅(qū)動細胞內(nèi)鈣離子泵出細胞或泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中儲存，以維持細胞內(nèi)低濃度的游離Ca2?，其測定具有重要的臨床和科研價值：臨床診斷：診斷和監(jiān)測心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肌肉疾病等毒理學研究：評估環(huán)境毒物和藥物對細胞鈣穩(wěn)態(tài)的影響生物學研究：了解細胞信號傳導(dǎo)、細胞凋亡和肌肉收縮機制農(nóng)業(yè)研究：研究植物抗逆機制和品質(zhì)改良環(huán)境監(jiān)測：評估水體和土壤微生物污染程度
測定原理
分光光度法/比色法
Ca2?-Mg2?-ATP酶催化ATP水解生成ADP和無機磷（Pi），通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性高低。反應(yīng)式如下： ATP→Ca2+?Mg2+?ATP酶ADP+PiATPCa2+?Mg2+?ATP酶ADP+Pi
ELISA法
采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Ca-Mg-ATPase，孵育清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成捕獲抗體-抗原-檢測抗體免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Ca-Mg-ATPase的濃度。
試劑盒組成
分光光度法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說明
提取液 液體100mL×1瓶 含Tris-HCl緩沖液（pH7.4），用于提取樣本中的Ca2?-Mg2?-ATP酶
試劑一 液體6mL×1瓶 含ATP溶液，反應(yīng)底物
試劑二 液體6mL×1瓶 含CaCl?溶液，激活劑，用于提高酶活性
試劑三 液體6mL×1瓶 含MgCl?溶液，激活劑，用于提高酶活性
試劑四 液體6mL×1瓶 含鉬酸銨溶液，顯色劑，用于檢測無機磷
標準品 液體1mL×1支 含無機磷標準品，用于建立標準曲線
ELISA法試劑盒
組分 規(guī)格 作用說明
包被板 96孔×1塊 預(yù)先包被Ca-Mg-ATPase捕獲抗體
酶標試劑 液體6mL×1瓶 含HRP標記的檢測抗體，用于檢測Ca-Mg-ATPase
標準品 0.3mL×6管 含Ca-Mg-ATPase標準品（15.625pg~1000pg/mL）
樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標準品
顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液
顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液
終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液
20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標板
自備儀器與試劑
必備儀器
分光光度法/比色法：可見光分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
ELISA法：酶標儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機、水平軌道微孔板振蕩器
通用：低溫離心機（≥8000g）、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、電子天平
必備耗材
離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器
自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、三氯乙酸
樣本前處理方法
動植物組織樣本取樣：稱取約0.1-0.2g組織，用生理鹽水洗凈表面雜質(zhì)，用濾紙吸干勻漿：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例進行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測稀釋：若ATP酶活性過高，用提取液稀釋1-10倍后測定
細胞樣本收集：收集1×10?細胞，加入1mL提取液破碎：冰浴超聲波破碎（功率20%，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測
血清/血漿樣本血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
測定操作步驟
分光光度法/比色法操作儀器預(yù)熱：分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到660nm，用蒸餾水調(diào)零標準曲線繪制：
將標準品稀釋成0、10、20、30、40、50μmol/L系列濃度
取100μL標準溶液于比色管中，加入100μL試劑一、100μL試劑二、100μL試劑三，混勻
37℃水浴反應(yīng)30min，加入100μL試劑四，混勻
室溫反應(yīng)15min，測定660nm處吸光度，繪制標準曲線樣品測定：
取100μL樣品溶液，按標準曲線步驟操作，測定吸光度
根據(jù)標準曲線計算樣品中Ca2?-Mg2?-ATP酶活性
ELISA法操作試劑準備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用標準品配置：從20ng/mL標準品(200μL)按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋1000pg/mL(例:50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液,制備得到1000μL的1000pg/mL濃度標準品),隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液,在這6個單獨的試管中1000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度,共配制7個濃度的標準品,依次為:1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL,從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中,輕輕吹打混勻,以此類推進行標準品的倍比稀釋,1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)加樣：從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔；37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計算：繪制標準曲線，按曲線方程計算樣本濃度
結(jié)果計算方法
單位定義
U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘催化生成1μmol無機磷的酶量
U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘催化生成1μmol無機磷的酶量
U/L：每升樣本每分鐘催化生成1μmol無機磷的酶量
pg/mL：每毫升樣本中Ca-Mg-ATPase的含量（ELISA法）
分光光度法計算公式
Ca2+?Mg2+?ATP酶活性(U/g鮮重)=(A測定?A空白)×C標×V總(A標準?A空白)×W×TCa2+?Mg2+?ATP酶活性(U/g鮮重)=(A標準?A空白)×W×T(A測定?A空白)×C標×V總
A測定：樣本管吸光度值
A空白：空白管吸光度值
A標準：標準管吸光度值
C標：標準品濃度（μmol/mL）
V總：樣本提取液總體積（mL）
W：樣本質(zhì)量（g）
T：反應(yīng)時間（min）
ELISA法計算公式
Ca-Mg-ATPase含量(pg/mL)=樣本OD值?空白OD值標準品OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)Ca-Mg-ATPase含量(pg/mL)=標準品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數(shù)
性能指標
指標 分光光度法 ELISA法
線性范圍 0~50μmol/L 15.625pg~1000pg/mL
最低檢測限 ≤0.1μmol/L ≤7.81pg/mL
回收率 90%~110% 90%~110%
批內(nèi)精密度 CV≤5.0% CV≤10%
批間精密度 CV≤8.0% CV≤15%
穩(wěn)定性 2-8℃保存12個月 2-8℃保存6個月
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免酶失活；-20℃可保存3個月
組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活
液體樣本需避免溶血和細菌污染，溶血標本不宜進行此項檢測
試劑使用：
不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線
TMB顯色液需避光保存，避免失效
ELISA法試劑需避免反復(fù)凍融，用后立即放回2-8℃保存
測定過程：
分光光度法反應(yīng)溫度需嚴格控制在37℃，反應(yīng)時間30分鐘
ELISA法需嚴格控制溫育時間和溫度，避免影響顯色反應(yīng)
若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定
質(zhì)量控制：
每次實驗需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本
定期校準儀器，確保檢測結(jié)果準確性
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確
其他注意事項：
終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹慎操作
某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧
顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧
佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品，處理后徹底洗手
公司正在出售的產(chǎn)品
蛋白酪氨SUAN激檢測試劑盒 PTK ELISA Kit | AR42J大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細胞 |
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