商品屬性
產(chǎn)品名稱 | 輔酶ⅡNADP(H)含量測試盒 | 產(chǎn)品貨號 | BH-961115 |
規(guī)格 | 00管/48樣、50管/24樣 | 產(chǎn)品分類 | 輔酶Ⅱ系列 |
測試方法 | 微量法、可見分光光度法 | 用途 | 僅供科研實(shí)驗(yàn) |
測定意義與原理
測定意義
輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物體內(nèi)重要的氧化還原輔酶，主要功能包括：能量代謝：參與磷酸戊糖途徑（PPP）、生物合成反應(yīng)（如脂肪酸、核苷酸、膽固醇合成）抗氧化防御：NADPH是谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶的輔酶，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)信號調(diào)控：NADPH/NADP+比值是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)，影響基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化病理關(guān)聯(lián)：NADP(H)代謝異常與糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等相關(guān)
測定原理
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH：NADPH含量測定：NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，在570nm下檢測吸光值NADP+含量測定：利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）還原NADP+為NADPH，再通過MTT還原法檢測總NADP(H)計算：總NADP(H) = NADPH含量 + NADP+含量氧化還原比值計算：NADPH/NADP+比值 = NADPH含量 / NADP+含量
自備儀器與試劑
必備儀器
可見分光光度計/酶標(biāo)儀（具備570nm檢測通道）
臺式高速離心機(jī)（最大轉(zhuǎn)速≥10000rpm）
恒溫水浴鍋（控溫精度±0.5℃）
可調(diào)式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超聲破碎儀（用于細(xì)胞/細(xì)菌樣本處理）
必備耗材
1mL玻璃比色皿/96孔板
離心管（1.5mL、10mL）
一次性吸頭（無菌無酶）
研缽/組織勻漿器（冰浴專用）
自備試劑
蒸餾水/去離子水
生理鹽水（用于樣本稀釋）
液氮（用于樣本速凍保存）
樣本前處理方法
組織樣本（動植物）新鮮樣本取材后立即液氮速凍，-80℃保存；避免反復(fù)凍融稱取0.05-0.1g組織，按1:5-10（W/V）比例加入預(yù)冷提取液冰浴勻漿（轉(zhuǎn)速1000-1500rpm，時間5-10min）轉(zhuǎn)移至離心管，10000rpm 4℃離心10min，取上清液置冰上待測若酶活性過高，可用提取液稀釋后測定（建議稀釋倍數(shù)1-10倍）
細(xì)胞/細(xì)菌樣本收集對數(shù)生長期細(xì)胞（密度1×10^6/mL）或細(xì)菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌2次按500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液的比例重懸冰浴超聲破碎（功率30%，超聲5s，間隔10s，重復(fù)20次）10000rpm 4℃離心10min，取上清液置冰上待測
血清/血漿/尿液樣本血清樣本：血液凝固后3000g 4℃離心10min，取上清血漿樣本：加入抗凝劑后3000g 4℃離心10min，取上清尿液樣本：直接取上清，若渾濁需3000g離心5min后取上清以上樣本可直接檢測，無需提取處理
測定操作步驟
分光光度法流程
試劑準(zhǔn)備：
從4℃取出試劑盒，室溫平衡20min
試劑工作液：按比例混合試劑A、B、C，現(xiàn)配現(xiàn)用
NADP+標(biāo)準(zhǔn)溶液：用蒸餾水稀釋至0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/L
NADPH測定：
取比色皿，依次加入：提取液900μL + NADPH提取液50μL + 樣本50μL
37℃預(yù)溫育5min，加入MTT溶液20μL立即混勻
室溫避光反應(yīng)20min，記錄570nm處吸光度A1
NADP+測定：
另取比色皿，依次加入：提取液900μL + NADP+提取液50μL + 樣本50μL
37℃預(yù)溫育5min，加入G6PDH溶液20μL立即混勻
室溫反應(yīng)10min后，加入MTT溶液20μL混勻，避光反應(yīng)20min，記錄570nm處吸光度A2
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：
以NADP+標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
計算回歸方程：y = kx + b（y為吸光度，x為NADP+濃度）
微量法（酶標(biāo)儀）流程96孔板每孔加入：提取液90μL + NADPH/NADP+提取液5μL + 樣本5μL37℃預(yù)溫育5min，加入MTT/G6PDH溶液2μL立即混勻酶標(biāo)儀設(shè)置動力學(xué)模式，570nm處連續(xù)讀取10個循環(huán)（每1min讀取1次）計算吸光度變化值（ΔA），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NADP(H)含量
含量計算方法
標(biāo)準(zhǔn)曲線法
NADPH/NADP+含量(μmol/g鮮重)=(ΔA樣本?b)×V樣總×稀釋倍數(shù)k×W×V樣測NADPH/NADP+含量(μmol/g鮮重)=k×W×V樣測(ΔA樣本?b)×V樣總×稀釋倍數(shù)
ΔA樣本：樣本吸光度變化值（A樣本 - A空白）
k：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率
b：標(biāo)準(zhǔn)曲線截距
V樣總：樣本提取液總體積（mL）
V樣測：測定時加入的樣本體積（0.05mL）
W：組織鮮重（g）
直接計算法
NADPH/NADP+含量(μmol/L)=ΔA×V反總×106ε×d×V樣NADPH/NADP+含量(μmol/L)=ε×d×V樣ΔA×V反總×106
ΔA：吸光度變化值（A2 - A1）
V反總：反應(yīng)體系總體積（1.0mL）
ε：甲瓚摩爾消光系數(shù)（約1.5×10^4 L/(mol·cm)）
d：比色皿光徑（1cm）
V樣：測定時加入的樣本體積（0.05mL）
注意事項
樣本處理：
樣本需新鮮制備，避免NADPH氧化；密封冷藏可保存24h
細(xì)胞/組織樣本需避免反復(fù)凍融，以免NADP(H)降解
環(huán)境樣本需過濾去除雜質(zhì)，避免干擾吸光度測定
試劑使用：
MTT溶液對光敏感，配制后需避光保存，24小時內(nèi)用完
試劑需按比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用；不同批號試劑禁止混用
6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）需-20℃分裝保存，避免反復(fù)凍融
測定過程：
反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃，避免溫度影響酶活性
若吸光度值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需調(diào)整稀釋倍數(shù)重新測定
每個樣本需設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值
質(zhì)量控制：
每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對照（蒸餾水替代樣本）和質(zhì)控樣本
若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否失效或樣本處理是否正確
若樣本NADP(H)含量較低，可延長反應(yīng)時間至60min或增加取樣量
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關(guān)鍵字： 輔酶ⅡNADP;H;測試盒;
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