線粒體蘋果酸脫氫酶（MDHm）測試盒

測定意義與原理

測定意義

MDH（EC1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。因此，MDH在細胞多種生理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。

根據不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH，細菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH分布于細胞質和線粒體中。

測定原理

MDHm催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致340nm處光吸收下降。通過測定340nm處吸光度的變化，計算MDHm活性。反應式如下： 草酰乙酸+NADH→MDHm蘋果酸+NAD+草酰乙酸+NADHMDHm蘋果酸+NAD+

試劑盒組成

紫外分光光度法/微量法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

試劑一 100mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的MDHm

試劑二 20mL×1瓶 含NADH溶液，反應底物

試劑三 1.5mL×1支 含草酰乙酸溶液，反應底物

試劑四 25mL×1瓶 含緩沖液，用于配制工作液

試劑五 粉劑×1瓶 含穩(wěn)定劑，用于穩(wěn)定反應體系

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預包被抗MDHm單克隆抗體

酶標抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標記抗MDHm抗體

標準品 液體1mL×6管 含0、2、4、8、16、32U/L MDHm標準品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標準品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標板

自備儀器與試劑

必備儀器

紫外分光光度法：紫外分光光度計、1mL石英比色皿

微量法：酶標儀（340nm檢測通道）、96孔板

ELISA法：酶標儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機

通用：臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽、冰和蒸餾水

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、三氯乙酸

樣本前處理方法

動植物組織樣本取樣：準確稱取0.1g組織，用生理鹽水洗凈表面雜質，用濾紙吸干勻漿：加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿低速離心：600g，4℃離心5min，棄沉淀，保留上清液高速離心：11000g，4℃離心10min，棄上清液，沉淀即為線粒體線粒體裂解：沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）檢測：裂解液用于MDHm酶活性測定

細胞樣本收集：收集500萬細胞到離心管內，離心后棄上清破碎：加入1mL試劑一和10μL試劑三，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）離心：11000g，4℃離心10min，棄上清液，沉淀即為線粒體線粒體裂解：沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）檢測：裂解液用于MDHm酶活性測定

血清/血漿樣本

血清/血漿樣本可直接檢測；若濃度過高，用提取液稀釋10-20倍

測定操作步驟

紫外分光光度法/微量法操作儀器預熱：分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零工作液配制：臨用前將試劑五加入試劑四，混合溶解，制備工作液樣本測定：

取10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻后立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2

同時設置空白對照，用蒸餾水替代樣本，同樣操作記錄吸光值變化標準曲線繪制：將MDHm標準品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測定1min內吸光值變化，繪制標準曲線

ELISA法操作試劑準備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入HRP標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值結果計算：繪制標準曲線，按曲線方程計算樣本濃度

結果計算方法

單位定義

U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

U/L：每升樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

紫外分光光度法/微量法計算公式

MDHm活性(U/mg prot)=(ΔA樣本?ΔA空白)×V總Cpr×V樣×ε×d×T×109MDHm活性(U/mg prot)=Cpr×V樣×ε×d×T(ΔA樣本?ΔA空白)×V總×109

ΔA樣本：樣本管吸光度變化值

ΔA空白：空白管吸光度變化值

V總：反應體系總體積（L）

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

V樣：樣本體積（L）

ε：NADH摩爾消光系數（6.22×103 L/mol/cm）

d：比色皿光徑（cm）

T：反應時間（min）

ELISA法計算公式

MDHm含量(U/L)=樣本OD值?空白OD值標準品OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數MDHm含量(U/L)=標準品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標準品濃度×稀釋倍數

性能指標

指標 紫外分光光度法/微量法 ELISA法

線性范圍 0~50U/L 0~32U/L

最低檢測限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批內精密度 CV≤5.0% CV≤5.0%

批間精密度 CV≤8.0% CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個月 2-8℃保存6-12個月

注意事項

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免MDHm失活；-20℃可保存3個月

勻漿過程需在冰浴中進行，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細菌污染

試劑使用：

工作液臨用前配制，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融

ELISA法試劑需避免反復凍融，用后立即放回2-8℃保存

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標準曲線

測定過程：

紫外分光光度法/微量法反應溫度需嚴格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）

ELISA法需嚴格控制溫育時間和溫度，避免影響顯色反應

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測定

質量控制：

每次實驗需設置空白對照和質控樣本

定期校準儀器，確保檢測結果準確性

若結果偏差較大，需檢查試劑是否變質或樣本處理是否正確

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