羥甲基戊二酰輔酶A合成酶（HMGCS）測試盒

測定意義與原理

測定意義

HMGCS是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA。其活性測定具有重要的臨床和科研價(jià)值：臨床診斷：診斷和監(jiān)測肝腎功能損傷、動脈粥樣硬化、心血管疾病、腫瘤等疾病監(jiān)測：評估細(xì)胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成、酮體生成和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選降脂藥物、抗癌藥物等

測定原理

HMGCS催化乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成羥甲基戊二酰CoA，同時(shí)產(chǎn)生CoASH，使DTNB轉(zhuǎn)化為黃色的TNB，在412nm下有特征吸光值。反應(yīng)式如下： 乙酰CoA+乙酰乙酰CoA→HMGCS羥甲基戊二酰CoA+CoASH乙酰CoA+乙酰乙酰CoAHMGCS羥甲基戊二酰CoA+CoASH CoASH+DTNB→CoA-S-TNB+黃色TNBCoASH+DTNB→CoA-S-TNB+黃色TNB

試劑盒組成

可見分光光度法/微量法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

提取液 液體100mL×1瓶 用于提取樣本中的HMGCS

試劑一 粉劑×1瓶 含乙酰CoA，反應(yīng)底物

試劑二 粉劑×1瓶 含乙酰乙酰CoA，反應(yīng)底物

試劑三 液體25mL×1瓶 含DTNB溶液，顯色劑

試劑四 液體5mL×1瓶 含緩沖液，用于配制工作液

標(biāo)準(zhǔn)品 液體×1支 含HMGCS標(biāo)準(zhǔn)液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法試劑盒

組分 規(guī)格 作用說明

包被板 96孔×1塊 預(yù)包被抗HMGCS單克隆抗體

酶標(biāo)抗體 液體6mL×1瓶 含HRP標(biāo)記抗HMGCS抗體

標(biāo)準(zhǔn)品 液體1mL×6管 含0.156-10ng/mL HMGCS標(biāo)準(zhǔn)品

樣本稀釋液 10mL×1瓶 用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品

顯色劑A液 6mL×1瓶 含過氧化氫溶液

顯色劑B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

終止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍濃縮洗滌液 20mL×1瓶 用于洗滌酶標(biāo)板

自備儀器與試劑

必備儀器

可見分光光度法：可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿

微量法：酶標(biāo)儀（412nm檢測通道）、96孔板

ELISA法：酶標(biāo)儀（450nm檢測通道）、96孔板、37℃恒溫箱、洗板機(jī)

通用：臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器、超聲破碎儀

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水

樣本前處理方法

細(xì)菌/細(xì)胞樣本收集：收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(10?個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

組織樣本取樣：按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測

血清/血漿樣本

血清(漿)樣品：直接檢測

測定操作步驟

可見分光光度法/微量法操作儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：臨用前將試劑一、試劑二分別用蒸餾水溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融樣本測定：

取500μL樣本上清，加入125μL試劑一、125μL試劑二和250μL試劑三，迅速混勻

記錄412nm下初始吸光值A(chǔ)1和4min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將HMGCS標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度，同樣處理，測定4min內(nèi)吸光值變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA法操作試劑準(zhǔn)備：將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，室溫平衡15-30分鐘；將20×洗滌緩沖液用蒸餾水20倍稀釋后備用加樣：

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加溫育：除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min洗滌：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）顯色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min終止：每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值結(jié)果計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算樣本濃度

結(jié)果計(jì)算方法

單位定義

U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmol TNB的酶量

U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘生成1nmol TNB的酶量

U/L：每升樣本每分鐘生成1nmol TNB的酶量

可見分光光度法/微量法計(jì)算公式

HMGCS活性(U/mg prot)=(ΔA樣本?ΔA空白)×V總Cpr×V樣×ε×d×T×109HMGCS活性(U/mg prot)=Cpr×V樣×ε×d×T(ΔA樣本?ΔA空白)×V總×109

ΔA樣本：樣本管吸光度變化值

ΔA空白：空白管吸光度變化值

V總：反應(yīng)體系總體積（L）

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

V樣：樣本體積（L）

ε：TNB摩爾消光系數(shù)（13.6×103 L/mol/cm）

d：比色皿光徑（cm）

T：反應(yīng)時(shí)間（min）

ELISA法計(jì)算公式

HMGCS含量(ng/mL)=樣本OD值?空白OD值標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)HMGCS含量(ng/mL)=標(biāo)準(zhǔn)品OD值?空白OD值樣本OD值?空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)

性能指標(biāo)

指標(biāo) 可見分光光度法/微量法 ELISA法

線性范圍 0~50U/L 0.156-10ng/mL

最低檢測限 ≤0.1U/L ≤0.05ng/mL

回收率 90%~110% 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤5.5% CV≤5.0%

批間精密度 CV≤3.3% CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存3個(gè)月有效 2-8℃保存6-12個(gè)月

注意事項(xiàng)

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免HMGCS失活；-20℃可保存3個(gè)月

操作過程需在4℃冰浴中進(jìn)行，避免酶失活

若樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測

試劑使用：

試劑臨用前配制，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融

不同批號試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

測定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）

加入樣品啟動反應(yīng)后需立即進(jìn)行比色測定，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確

比色測定初始讀數(shù)（20秒讀數(shù)）0.4左右為理想狀態(tài)

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

公司正在出售的產(chǎn)品