順烏頭酸酶(ACO)測(cè)試盒

測(cè)定意義與原理

測(cè)定意義

順烏頭酸酶（ACO）是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。其活性測(cè)定具有重要的臨床和科研價(jià)值：臨床診斷：診斷和監(jiān)測(cè)線粒體疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等疾病監(jiān)測(cè)：評(píng)估細(xì)胞能量代謝狀態(tài)、組織損傷程度和治療效果生物學(xué)研究：了解線粒體功能、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖機(jī)制藥物研發(fā)：篩選線粒體靶向藥物，用于治療線粒體疾病和神經(jīng)退行性疾病環(huán)境監(jiān)測(cè)：評(píng)估環(huán)境污染對(duì)生物線粒體的影響

測(cè)定原理

ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+還原生成NADH，導(dǎo)致340nm處光吸收上升。通過測(cè)定340nm處吸光度的變化，計(jì)算ACO活性。反應(yīng)式如下： 檸檬酸→ACO順烏頭酸→ACO異檸檬酸檸檬酸ACO順烏頭酸ACO異檸檬酸 異檸檬酸→異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸+CO2+NADH異檸檬酸異檸檬酸脫氫酶α-酮戊二酸+CO2+NADH

試劑盒組成

組分 規(guī)格 作用說明

試劑一 25mL/50mL/100mL×1瓶 含提取液，用于提取樣本中的ACO

試劑二 25mL/50mL/100mL×1瓶 含緩沖液，用于提供適宜的反應(yīng)pH環(huán)境

試劑三 1.5mL×1支 含輔助因子，反應(yīng)輔助因子

試劑四 25mL/50mL/100mL×1瓶 含底物液，反應(yīng)底物

試劑五 粉劑×1瓶 含酶溶液，反應(yīng)輔助因子

標(biāo)準(zhǔn)品 1mL×1支 含ACO標(biāo)準(zhǔn)品（100U/L），用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

自備儀器與試劑

必備儀器

比色法/紫外分光光度法：可見分光光度計(jì)/紫外分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿/1mL石英比色皿、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、電子天平

微量法：酶標(biāo)儀、96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、恒溫水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、電子天平

必備耗材

離心管（1.5mL/10mL）、一次性吸頭、研缽/組織勻漿器

自備試劑：蒸餾水/去離子水、生理鹽水、三氯乙酸

樣本前處理方法

動(dòng)物組織樣本取樣：稱取約0.1g組織，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干勻漿：加入1mL試劑一，冰浴勻漿離心：8000g 4℃離心10min，取上清檢測(cè)：上清液用于ACO活性測(cè)定蛋白濃度測(cè)定：用考馬斯亮藍(lán)法或BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度

細(xì)胞/細(xì)菌樣本收集：收集500萬細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心后棄上清破碎：加入1mL試劑一，超聲波破碎（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次）離心：8000g 4℃離心10min，取上清檢測(cè)：上清液用于ACO活性測(cè)定

血清/血漿樣本

血清/血漿樣本可直接檢測(cè)；若濃度過高，用提取液稀釋10-20倍

測(cè)定操作步驟

儀器預(yù)熱：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm，蒸餾水調(diào)零試劑配制：

試劑五：臨用前加入5mL蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融

工作液：臨用將試劑五轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融工作液預(yù)熱：將工作液置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min樣本測(cè)定：

在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑三，混勻，記錄340nm處20s時(shí)吸光值A(chǔ)1和1min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0、10、20、30、40、50U/L系列濃度

同樣處理，測(cè)定1min內(nèi)吸光值變化，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果計(jì)算方法

單位定義

U/mg prot：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

U/g 鮮重：每克鮮重樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

U/L：每升樣本每分鐘消耗1nmol NADH的酶量

計(jì)算公式

ACO活性(U/mg prot)=1808×ΔACprACO活性(U/mg prot)=Cpr1808×ΔA ACO活性(U/g 鮮重)=18.08×ΔAWACO活性(U/g 鮮重)=W18.08×ΔA ACO活性(U/L)=0.73×ΔAV樣ACO活性(U/L)=V樣0.73×ΔA

ΔA：1min內(nèi)吸光度變化值

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

W：樣本質(zhì)量（g）

V樣：樣本體積（L）

性能指標(biāo)

指標(biāo) 比色法/紫外分光光度法/微量法

線性范圍 0~60.19U/L

最低檢測(cè)限 ≤2.32U/L

回收率 90%~110%

批內(nèi)精密度 CV≤5.0%

批間精密度 CV≤8.0%

穩(wěn)定性 2-8℃保存6-12個(gè)月

注意事項(xiàng)

樣本處理：

樣本需新鮮制備，避免ACO失活；-20℃可保存3個(gè)月

組織樣本需冰浴勻漿，避免酶失活

液體樣本需避免溶血和細(xì)菌污染

試劑使用：

試劑五需臨用前配制，避免氧化失效

不同批號(hào)試劑不能混用，需重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品需4℃保存，避免反復(fù)凍融

測(cè)定過程：

反應(yīng)溫度需嚴(yán)格控制在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）

加入試劑后需充分混勻，確保反應(yīng)完全

若吸光度值超出線性范圍，需稀釋樣本后重新測(cè)定

質(zhì)量控制：

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置空白對(duì)照和質(zhì)控樣本

定期校準(zhǔn)儀器，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性

若結(jié)果偏差較大，需檢查試劑是否變質(zhì)或樣本處理是否正確

公司正在出售的產(chǎn)品